从机制、筛查到治疗，匡洪宇教授带您全方位了解糖网最新进展

编者按：糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，严重影响患者的生活质量和预后。然而，目前针对DR的有效治疗手段仍然有限，因此探讨其发病机制以寻找更好治疗靶点以及防控策略成为糖尿病研究领域的重要课题之一。近日召开的第57届欧洲糖尿病研究协会年会（EASD2021）专门设置了“认识DR”专题（OP 06），6项最新研究结果在此公布，本刊特邀哈尔滨医科大学附属第一医院匡洪宇教授对此介绍并予以精彩点评。

OP 06-31:使用SDRNT1BIO队列评估黄斑病变深度学习预测模型

背景和目的：DR和黄斑病变是糖尿病患者致盲的主要原因。目前，包括苏格兰在内的许多国家都有便于早期发现的基于眼底照相的筛查方案。在苏格兰，许多疑似黄斑病变患者从筛查项目转诊至专科医生诊治，但随后返回筛查项目中，这表明黄斑病变未得到专家确认。通过眼底照相准确预测黄斑病变，可减少人们不必要的就医。本研究旨在确定使用视网膜图像的深度学习预测模型能否预测苏格兰DR筛查项目中疑似黄斑病变被转诊至专科诊治且未返回筛查项目的患者。

材料和方法：研究人员训练了一个RegNetY016网络来预测糖尿病黄斑水肿（DME），数据来自DR临床研究网络以及Kaggle-EyePACS和Messidor数据集，使用了25 557张眼底图像。研究人员对本研究中的RegNetY016模型以及公众可用的DeepSeeNet和ARIANNA年龄相关性黄斑变性预测模型进行了评估。评估数据包含68 488张眼底图像（886张被转诊且未返回），这些图像来自苏格兰1型糖尿病（T1DM）生物资源中2005~2017年参加苏格兰国家筛查项目的5539例受试者。评价结局定义为图像被分级为可转诊且相应患者未返回筛查项目。评估排除2年内拍摄的最新图像和患者死亡前2年内拍摄的图像。

结果：RegNetY016模型识别的疑似黄斑病变图像且相应患者未返回筛查项目的AUC曲线下面积（AUROC）为0.85。DeepSeeNet预测模型识别这一结局的AUROC为0.75，而ARIANNA模型仅为0.60。

结论：深度学习预测模型能够根据眼底图像识别苏格兰筛查项目中因黄斑病变而被转诊治疗且后续未返回筛查项目的患者。这表明，深度学习模型可能是一个有效工具，以帮助减少不必要的黄斑病专家预约。

OP 06-32:全外显子组和全基因组测序揭示T1DM严重DR的新罕见遗传变异

背景和目的：遗传因素在DR的易感性中发挥作用，但旨在识别DR相关遗传因素的研究仍很少。本研究的目的是在芬兰糖尿病肾病（FinnDiane）研究中，通过全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）研究，发现T1DM中与严重DR（SDR）相关的罕见变异。

材料和方法：研究人员分别对大约600例和500例T1DM患者进行了WGS和WES。WES在Illumina HiSeq2000上完成，WGS在Illumina HiSeq X平台上完成，至少覆盖30倍，两者均与GRCh38参考基因组进行比对。SDR表型基于主治医生、医疗记录和截至2017年底的芬兰医院出院登记处提供的数据。SDR定义为出现首次激光光凝治疗事件或增殖性DR诊断。对照组至少20年无SDR。经过表型确定和质量控制，研究群体包括490例患者WES（390例）和583例患者WGS（405例）。对于WES和WGS的外显子区域，通过评分检验和METAL荟萃分析进行相关性检验；对于其他区域，用WGS的Firth回归检验相关性。利用WES和WGS对具有两个小等位基因频率阈值（5%和1%）的蛋白改变或截短变异进行SKAT-O基因聚合试验，以提高检测低频率和罕见变异关联的能力。分析中的协变量包括性别、发病年龄和测序数据集主成分1和2。

结果：单标志物荟萃分析显示，SDR有6个变异P<10-5，其中与LDB3上的同义变异rs372789789（MAF=0.2%，P=4.6×10-7）和PASK上的同义变异rs56043607（MAF=0.6%，P=8.2×10-7）的相关性最强。在外显子外，SDR的11个位点变异P<10-5，其中与1个基因间变异rs9940767的相关性最强（MAF=22%，P=5.7×10-7）。在WGS中蛋白截短变异负担最强（MAF<5%和MAF<1%）的基因为UACA（SKAT-O P=9.6×10-4），在WES中亦如此（P=0.02）。UACA是一种具有螺旋结构域和锚蛋白重复的葡萄膜自身抗原，与全葡萄膜炎有关。在既往发现与SDR相关的CACNB2基因上，研究人员发现1个与SDR相关的内含子变异（rs4747341，WGS P=8×10-4）。WGS未发现与CACNB2基因聚合试验相关的信号，但CACNA1C的蛋白改变变异与SDR相关（MAF<1%，SKAT-O P=0.001），而CACNA1C与CACNB均为同一钙通道的一部分。

结论：WES和WGS的数据表明，UACA中罕见的蛋白截短变异与T1DM患者的SDR风险有关。通过对CACNB2基因的查找，研究人员发现CACNB2基因上的内含子变异与CACNA1C基因上的蛋白改变变异相关，二者均为同一钙通道的一部分。

OP 06-33:绘制糖尿病视网膜每日节律转录组

背景和目的：眼睛是一种有节律的器官，通过功能性生物钟专门进化出围绕光周期发挥作用的功能。据报道，糖尿病等疾病会破坏生物钟，而生物钟破坏成为影响疾病预后和治疗成功的重要因素。研究人员绘制了小鼠视网膜节律转录组，以了解糖尿病导致的生物钟破坏程度。

材料和方法：健康对照小鼠和Ins2Akita/J糖尿病小鼠在生理性12h:12h光暗周期下饲养至4月龄。在昼夜周期前后每4小时采集一次视网膜，进行深度mRNA测序。计算方法用于检测节律性（经验性JTK_CYCLE，P<0.05，fc>1.25）、峰值预测（谐波回归分析）、差异节律模式（DORD，P<0.05）、相集富集分析（P<0.05）和上游调控因子预测。在人视网膜内皮细胞的体外实验中进行验证。

结果：近10%的视网膜转录组被鉴定为有节律，具有明显的12小时转录活性轴，在中午和午夜达到峰值。尽管12小时转录轴保留在糖尿病视网膜中，但它大约提前了1~3小时。与对照组相比，共有478个基因在糖尿病中被鉴定为有节律性差异的基因。相移基因（405个转录本）多于振幅改变基因（154个转录本）。

糖尿病没有改变生物钟的相位。但相集富集分析显示，氧化磷酸化在糖尿病视网膜中提前近4小时。那时糖尿病小鼠血液中的葡萄糖水平达到峰值，可能驱动了视网膜中的代谢变化。下游分析确定氧感知机制和HIF1A是相移的主要上游调节因子。

结论：这是首次研究糖尿病对视网膜节律输出的影响。重要的是，我们已经开始剖析糖尿病视网膜中这种节律破坏的来源，并发现在糖尿病视网膜中生物钟被保留下来，但代谢紊乱改变了视网膜中的一组基因，这可能导致组织内部的时差反应。

OP 06-34:甲基乙二醛对人视网膜内皮细胞的转录和转录后影响：DR的新成员？

背景和目的：甲基乙二醛（MGO）是糖酵解的一种高反应性副产物，在糖尿病患者体内累积会对血管功能不利。MGO介导高糖诱导的大血管内皮细胞改变，但对人视网膜内皮细胞（hRECs）的影响尚未阐明。本研究评估了MGO在hRECs中的功能和分子效应，确定了DR内皮损伤的调控网络。

材料和方法：将市售原代hRECs暴露于500μM MGO 72小时进行功能测定（MTT、细胞迁移和成管）。转录组和miRNA组（miRNome）分析分别采用RNA-Seq（约60M双端测序读数/样本）和小RNA-Seq（10M单端测序读数/样本）。采用TopHat、RNA-SeqGUI和iSMART进行制图和数据归一化。差异表达（DE）基因的生物进程/通路（edgeR工具，FDR≤0.05）和miRNAs（NOISeq工具，Prob≥0.9）通过开源数据库/工具（KEGG、DAVID、Panther、miRPathDB、Reactome）进行鉴定。使用ENCODE ChIP-Seq工具和miRPathDB来选择DE基因中具有丰富结合位点的转录调控因子（TRs）和miRNAs。通过STRING和miRnet分析蛋白-蛋白和miRNA-基因的相互作用。

结果：MGO显著损害hRECs的细胞迁移和成管能力（P≤0.05），并诱导涉及基因表达调控（454个基因）、细胞周期（108个基因）、细胞增殖（104个基因）、细胞死亡（95个基因）、细胞粘附（79个基因）和血管形成（44个基因）的广泛基因转录干扰。神经元限制性沉默因子（NRSF/REST）是在约60%（1009个基因）的DE基因中具有丰富结合位点（Q≤0.05）的TRs之一。根据ENCODE ChiPSeq数据，NRSF/REST被预测能够调控涉及基因表达调控（约70%）、细胞周期（约78%）和细胞死亡（约74%）的大多数DE基因，表明其是MGO诱导hRECs失调的一个可靠中介物。值得注意的是，受限相互作用网络表明，NRSF/REST作为枢纽，连接多个已知在视网膜生成（如Hipk、Ngfr）、视网膜神经元细胞（如Jun、FosL2、Hes1）和/或DR（如p53、Vegfa、Sirt1）中起作用的失调因子。此外，分析显示，MGO导致83个miRNAs失调，并靶向大约75%的DE基因（1354个基因）。值得注意的是，参与NRSF/REST限制网络的上调因子是23个下调miRNAs的靶点。因此，研究人员重建了一个失调mRNA-miRNA相互作用网络，可能介导了MGO诱导的hRECs转录和转录后干扰。

结论：本研究揭示了MGO诱导hRECs的功能和分子效应，其代表了DR中主要事件的假定中介。MGO直接诱导视网膜内皮细胞的转录和转录后改变。NRSF/REST、其他关键蛋白编码基因改变和miRNAs失调之间的相互作用网络可能维持这些效应。针对候选mRNAs/miRNAs能否抑制MGO对hRECs的有害影响的实验分析正在进行，将揭示视网膜微血管细胞中糖毒性的分子介质。

OP 06-35:儿童T1DM患者视网膜神经退行性变两年进展：血糖变异性的作用

背景和目的：视网膜神经退行性变（RN）被认为是DR的早期标志物，先于血管损伤出现。在T1DM儿童中，关于血糖控制和每日血糖变异性（GV）对早期RN的影响和预测作用的数据很少。本研究旨在无任何并发症的T1DM儿童中，评估两年内视网膜神经结构改变以及GV对RN的预测作用。

材料和方法：入选25例采用持续葡萄糖监测（CGM）和持续皮下胰岛素输注且无任何并发症的T1DM患者（年龄10~20岁）以及18例年龄与性别相近的健康对照者，随访2年。所有受试者接受海德堡光谱光学相干断层扫描，分析所有黄斑神经视网膜层，测量中心凹下、内外象限的平均值。计算T1DM患者的HbA1c、GV和标准化CGM指标。收集基线、12个月和24个月时的数据。

结果：与对照组相比，T1DM患者基线时视网膜神经纤维层（RNFL）内段厚度明显变小（91.8±6.9 μm vs. 96.5±5.6 μm，P=0.02）；12个月和24个月时视网膜外网层（OPL）的内象限（12个月：152.8±9.4 μm vs. 163.9±12.8 μm，P<0.01；24个月：150.3±9.5 μm vs. 163.5±12.8 μm，P<0.01）和整个象限（12个月：257.1±12.6 μm vs. 286.4±66.5 μm，P=0.05；24个月：254.3±10.2 μm vs. 289.6±67.6 μm，P=0.05）均明显变薄；24个月时视网膜内层厚度（IRT）明显更薄（1201.3±40.5 μm vs. 1244.1±61.6 μm，P=0.04）。

T1DM患者在随访2年后，OPL和IRT呈进行性下降（P<0.05）。在T1DM患者中，基线时连续重叠净血糖作用（CONGA-1h）和RNFL内段呈负相关（r=-0.42，P=0.05）；24个月时平均绝对葡萄糖（MAG）和OPL内象限呈负相关（r=-0.53，P=0.04）；IRT δ厚度（24个月-12个月）与血糖不稳定指数（r=-0.64，P=0.01）、MAG（r=-0.61，P=0.02）呈负相关。HbA1c与黄斑层厚度无显著相关性（P>0.05）。在代谢指标中，甘油三酯水平与IRT δ厚度（24个月-12个月）呈负相关（r=-0.67，P<0.01）。

结论：在无血管视网膜病变和神经病变的T1DM儿童中，视网膜神经的早期形态学改变已经存在，支持RN发生在糖尿病早期的假设。GV似乎在T1DM儿童的神经感觉视网膜形态异常中发挥预测作用。将来需纵向评估以确定视网膜神经损伤是否可作为糖尿病神经病变的一种预测标志物。

OP 06-36:羟苯磺酸钙在亚临床糖尿病黄斑水肿患者中的作用：CADODIAME研究

背景和目的：羟苯磺酸钙（CaD）在多个国家被批准用于DR治疗，多项随机安慰剂对照临床试验证实了其对延缓早期DR进展的疗效。然而，在CALDIRET研究中，CaD并未降低临床显著黄斑水肿（CSME）的发生风险。总的来说，这些研究数据表明，CaD用于早期DR有益，但还需更多临床证据支持。视网膜厚度（RT）似乎是DME的一个良好预测指标，亚临床DME患者是评估预防CSME治疗策略的良好目标人群。在此基础上，本研究旨在检测CAD用于DR早期的作用，包括对亚临床DME到CSME进展的影响。

材料和方法：在这项随机、多中心、安慰剂对照、平行组研究中，60例符合条件伴亚临床DME的2型糖尿病患者以1:1比例随机接受CaD（1000 mg bid）或安慰剂治疗，为期1年。主要终点是确定CaD能否预防RT增加。次要终点是评估CaD能否阻止：①亚临床DME到CSME进展；②ETDRS进展（≥1步）；③神经退行性变进展；④视力下降；⑤中心凹无血管区（FAV）扩大。

结果：共有50例患者完成1年随访。CaD患者RT平均降低2.5 μm，而安慰剂组平均增加3.8 μm，但差异无统计学意义（P=0.26）。关于次要终点，唯一差异是CaD对ETDRS进展的影响：与安慰剂组的3例相比，CaD组的9例患者ETDRS有所改善（37.5% vs. 12%，P=0.05）。在校正年龄、高血压和平均HbA1c（检测4次）的logistic回归分析中，CaD治疗与1年随访结束时ETDRS改善独立相关（P=0.03）。安慰剂组和CaD组之间未发现任何不良反应差异。

结论：在本研究中至少1年随访后，CaD治疗对RT进展无任何显著影响。然而，ETDRS改善的结果表明，CaD是一种安全有效的治疗DR早期微血管损伤的方法。未来有必要在更大规模患者中开展更长期随访的研究。

专家点评

匡洪宇 哈尔滨医科大学附属第一医院

2021 EASD年会上关于DR的报道给我们带来了新的信息，从细胞、动物、人体研究等多维度探讨了DR的发病机制、早期筛查及治疗方法。①在细胞层面上，M. Aprile等人证实了MGO对人视网膜内皮细胞的转录和转录后影响，并构建了DR内皮损伤的mRNA-miRNA相互作用网络。②在动物层面上，H.R. Winter等人在生理性12h:12h光暗循环下分别饲养健康对照组和ins2kita/J糖尿病小鼠，发现视网膜转录组是有昼夜节律的，虽然12小时转录轴保留在糖尿病视网膜中，但其相位提前约1~3小时，这是首次映射糖尿病对视网膜节律性输出影响的研究。③在一项随机、多中心、平行、安慰剂对照研究中，证实CaD治疗随访1年对RT进展没有影响，但对早期微血管损伤有效。④ N. Vuori等利用全外显子组和全基因组测序揭示了T1DM中SDR的新型罕见遗传变异——UACA蛋白截短突变，此突变增加了T1DM患者的SDR风险。⑤ Menduni等人对25例接受CGM及皮下胰岛素输注治疗的T1DM患儿（无任何并发症）连续随访2年，证实血糖控制情况和每日GV对T1DM儿童患者早期视网膜神经变性体征的影响和预测作用。⑥ J. Mellor等人利用人工智能技术，建立深度学习预测模型（RegNetY016）甄别黄斑病变患者的眼底图像，该模型AUROC值为0.85，明显高于其他同类模型，有助于减少临床医生的工作量。