即‘专一”又“通吃”：中性粒细胞选择杀死不同类型的肿瘤

撰文 | 雪月

责编 | Qi

在治疗肿瘤的过程中，除了要克服肿瘤组织内高度的异质性之外，还需要避开靶向正常细胞。因此，在寻找克服肿瘤的方法时，既需要最大限度的在多种类型的肿瘤中发挥广谱抗肿瘤作用，又需要极大的降低对于机体的毒副作用。

机体的先天免疫系统可以抵抗多种传染性疾病，包括细菌、真菌以及原生动物，这些病原体的遗传变异性远超肿瘤细胞。中性粒细胞作为先天免疫系统中重要的效应细胞可以消除多种类型的病原体，那么中性粒细胞在肿瘤中或许具有相当的作用。有研究表明多形核中性粒细胞 （polymorphonuclear neutrophils PMN）可以杀死肿瘤细胞，其潜在临床应用价值还在研究中，但是其中的机制还未完全了解。

也有研究发现不同于PMN的抗肿瘤功能，中性粒细胞可以促进肿瘤。这些研究结果或许是由于中性粒细胞的物种差异引起的。在小鼠中，有研究发现肿瘤细胞会使中性粒细胞释放肿瘤细胞转移分子，肿瘤相关中性粒细胞增加是预后不良的指标。

近日，来自芝加哥大学的Lev Becker 团队在Cell杂志上发表题为 Neutrophil elastase selectively kills cancer cells and attenuates tumorigenesis 的文章，该文章发现多形核中性粒细胞来源的抗肿瘤分子ELANE，可以选择性杀伤肿瘤细胞。

人PMN在体内的半衰期只有八小时，经过凋亡释放抗微生物分子。为了检测这些分子是否也能够杀死肿瘤细胞，作者从凋亡PMN获得无血清条件培养基并分别用其处理35种不同类型的人与小鼠肿瘤细胞，分析发现PMN条件培养基通过促进肿瘤细胞凋亡可以杀死35种类型的肿瘤，而对非肿瘤细胞没有细胞毒性。杀死肿瘤细胞的效应可以被血清抑制。将肿瘤细胞系移植入小鼠体内，注射PMN条件培养基到肿瘤组织内会抑制肿瘤生长，促进细胞凋亡。而PMN条件培养基注射入没有肿瘤的小鼠体内或者乳腺脂肪垫则不会引起凋亡反应。

为了检测这种效应是否存在于所有的中性粒细胞，作者分离了多个部位的肿瘤与非肿瘤的人与小鼠来源的中性粒细胞，并构建条件性培养基。作者发现所有人来源的条件性培养基都能杀死小鼠和人肿瘤细胞，而小鼠的都不行。

接下来作者开始寻找杀死肿瘤的物质成分。作者首先开发了一套追踪生物分子杀伤活性定量系统。接着作者将条件性培养基进行煮沸、透析以及不同孔径过滤等方法进行分离以寻找目标分子。作者发现将PMN条件培养基用0.22 μm滤膜过滤后，杀伤肿瘤活性消失了。Shotgun蛋白组学定量分析发现过滤后的定量培养基中，在能检测到的890种蛋白质中，只有两种明显下降：neutrophil elastase (ELANE) 和eosinophil cationic protein (ECP)。ELANE是一种丝氨酸蛋白酶，先前的研究发现其促进肿瘤发生。ECP是一种能够杀死肿瘤细胞和非肿瘤细胞的打孔蛋白。有研究发现T细胞可以通过蛋白酶和打孔蛋白杀伤肿瘤细胞，而本研究发现中性粒细胞也可能存在类似的功能。用IP抗体分别去除PMN条件培养基中的ELANE或者ECP会消除肿瘤细胞杀伤作用。纯化两种蛋白再处理细胞发现ELANE以浓度依赖的方式杀伤肿瘤细胞而不会对人巨噬细胞产生影响，但是ECP对肿瘤细胞和巨噬细胞都有毒性。进一步分析发现PMN培养基中ECP的浓度水平不会杀伤肿瘤确能够明显促进ELANE的杀伤作用，提示二者存在协同作用。用PMSF抑制ELANE则能够去除肿瘤杀伤作用，表明ELANE是起重要作用的蛋白。并且作者发现在PMN条件培养基中，ECP能够与ELANE结合，这就解释了为什么去除ECP时，条件培养基的肿瘤细胞杀伤作用消失，ECP具有生物膜的高度亲和力，导致0.22um滤膜选择性去除ECP。

接下来作者开始寻找小鼠的ELANE与人的ELANE不同的原因。在排除了是由于氨基酸序列的区别后，作者发现老鼠的中性粒细胞细胞条件培养基中的ELANE没有活性，由此提出了假设可能有一抑制蛋白的存在。利用Shotgun 蛋白组学定量分析的技术，作者发现slpi 只在小鼠中性粒细胞的培养基中，但不在人的里面。应用IP实验，作者发现SLPI（Secretory leukocyte peptidase inhibitor）可以与ELANE结合，抑制ELANE活性。

下一步是探寻，ELANE 是如何杀癌细胞的。有研究发现CD95表达量降低会得到类似于ELANE的肿瘤细胞杀伤作用，作者接下来开始探索CD95在这一过程中的作用。通过质谱作者鉴定出了两个剪切位点 V220-A221与 I331-Q332。ELANE可以剪切CD95，释放含有死亡结构域 (death domain) 的碳末端，导致细胞死亡。用siRNA敲降介导ELANE摄入过程的受体NRP1，抑制肿瘤细胞对于ELANE的摄入，抑制肿瘤细胞杀伤作用。

下一步是探寻为什么ELANE-CD95-DD 的通路只杀癌细胞，不杀非癌细胞。作者分别在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中过表达flag-DD-ELANE，通过IP-LC-MS/MS，作者筛选到组蛋白H1四个异构体可以与flag在肿瘤细胞中结合，而不是非肿瘤细胞。通过promximity ligation imaging technology, 作者发现ELANE处理肿瘤细胞后，H1会迅速从细胞核转位至线粒体，这一点在非癌细胞里没有观察到。H1的表达在肿瘤细胞中明显上升，敲降肿瘤细胞中的H1会抑制ELANE的细胞杀伤作用，增加H1的表达在非癌细胞可以诱使elane 对他们有杀伤力。通过这一系列的实验，作者提出H1表达的量可能是决定elane-cd95-dd 通路是否有效的关键。

为了检测ELANE在体内的效应，作者在8个不同的癌症模型做了检测，发现ELANE都有抗癌效果。 因为ELANE选择性杀伤肿瘤细胞，这也导致肿瘤抗原的释放，肿瘤组织内DC CD8+T细胞、杀伤T细胞数量增加。而肿瘤微环境中的丝氨酸蛋白酶抑制剂是ELANE发挥作用的障碍，包括A1AT SLPI SERPINB1。最后作者用猪胰弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase PPE）进行杀伤肿瘤的体内与体外实验。猪胰弹性蛋白酶与ELANE具有32%氨基酸一致性，相似的蛋白结构以及底物特异性，但是二者对抑制剂敏感性不同。作者发现猪胰弹性蛋白酶可以显著提高抗肿瘤效果。

总的来说，本文鉴定出选择性杀伤肿瘤细胞、中性粒细胞来源的ELANE以及其杀伤肿瘤细胞的机制。未来旨在探究ELANE作为单一疗法或者与其他方法联合治疗时最大化其治疗效果。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.016

制版人：十一

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