杀虫剂双甲脒对蜜蜂和瓦螨的选择性毒力

责编 | 酶美

发现和确定杀虫剂的作用机理是昆虫毒理学研究的核心问题，无论是对于研究杀虫剂的选择性毒力以及对环境生物的潜在影响，害虫抗药性的监测和管理，还是基于靶标的杀虫剂设计和筛选等都非常重要。甲脒类杀虫剂包括杀虫脒，双甲脒等是一类重要的杀虫杀螨农药，其中杀虫脒目前已经不在使用，而双甲脒则仍用于控制各种叶螨、粉虱、介壳虫等。另外，双甲脒对哺乳动物低毒，对蜜蜂基本无毒，所以还广泛用于防治家畜和宠物的各种外寄生虫以及蜂巢中的狄斯瓦螨（Varroa destructor）【1】。尽管很早就通过体外生理学实验发现甲脒类杀虫剂可能作用于昆虫的章鱼胺受体（类似哺乳动物肾上腺素受体的G蛋白偶联受体家族），但是对于其引起的细胞下游信号反应仍存在争议【2, 3】。随着分子生物学和基因组学的发展，人们发现在节肢动物的基因组中存在多种章鱼胺受体基因，各自的下游信号通路也不同，那么到底哪一个是甲脒类杀虫剂的主要靶标，或者说哪些受体的激活才导致了害虫的致死效应，这些问题还不清楚。

近日，浙江大学黄佳课题组在eLife发表题为 An octopamine receptor confers selective toxicity of amitraz on honeybees and Varroa mites 的论文，利用分子药理学结合果蝇遗传学的方法，首次证实双甲脒通过激活害虫体内的Octβ2R型章鱼胺受体，从而导致过度兴奋而死亡。更重要的是，通过比较蜜蜂和瓦螨Octβ2R的结构和药理学性质，发现其中配体结合口袋的三个氨基酸差异决定了双甲脒对两者的不同毒力，从而使得其可以安全高效地防治这种对蜂群产生毁灭性打击的寄生螨。

作者首先通过比较瓦螨的四种章鱼胺受体（VdOAMB，VdOctα2R，VdOctβ2R，VdOct-TyrR）对双甲脒和其主要代谢产物DPMF的敏感性，希望能发现其中对杀虫剂特别敏感的受体来进一步证实，或者排除其中对杀虫剂没有反应的受体以缩小研究范围。但是，体外药理学实验结果表明两种化合物都可以强力激活所有四种章鱼胺受体，EC50值也都在纳摩浓度（图1）。2013年有国外的学者报道，发现一种牛的外寄生虫微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）对双甲脒产生了抗性，而且可能与该蜱虫的RmOctβ2R受体的第一跨膜域上的I61F点突变相关。但是在瓦螨的VdOctβ2R受体的对应位置上引入该点突变（I40F）后，发现突变体并没有对双甲脒和DPMF产生抗性（图1）。所以，比较药理学和抗性点突变验证都无法确认或排除其中一类章鱼胺受体作为体内分子靶标的可能性。考虑到目前还无法在瓦螨中实现RNAi或CRISPR基因组编辑，研究人员收集和制作了黑腹果蝇不同章鱼胺受体基因的敲除突变体来进行后续实验。之前在家蝇中发现一个P450解毒酶CYP12A1可以代谢双甲脒，该基因在蜜蜂和瓦螨的基因组中不存在但在果蝇中是保守的，所以导致双甲脒对果蝇的毒性很低，于是作者选择了两种行为学实验来代替生物测定。早期研究表明低浓度的双甲脒可以导致害虫因为神经系统过度兴奋而从寄主植物或动物上脱落，双甲脒在蜂巢中也是让瓦螨从蜜蜂体表掉落而饿死。实验发现果蝇在喂食双甲脒后也出现了类似的高度兴奋的状态，表现为雄性间的攻击性显著升高和运动行为的增加。但是在所有章鱼胺受体基因的突变体中，只有敲除了Octβ2R的果蝇产生了对双甲脒的行为学抗性，表明其在体内发挥作用需要通过Octβ2R受体。那么体内药物激活Octβ2R受体是否就足以产生致死效应呢？因为Octβ2R受体是偶联Gs蛋白的GPCR，激活后通常会增强神经元的兴奋性，那么通过GAL4-UAS系统在神经元表达TRPA1这一温度敏感的离子通道，就可以模拟受体被药物过度激活后的反应。实验发现只有当Octβ2R-Gal4所标记的神经元被热激活后，果蝇表现出过度兴奋，行为不受控制进而迅速瘫痪的表型，与双甲脒引起害虫中毒的症状类似。以上结果充分说明了Octβ2R受体是双甲脒在昆虫体内唯一的分子靶标。

图1 Octβ2R受体是双甲脒在昆虫体内唯一的分子靶标

接下来要回答的问题是为什么双甲脒对蜜蜂安全而对瓦螨高毒？之前的报道表明蜜蜂和果蝇不一样，并不能通过代谢解毒双甲脒，那么克隆表达蜜蜂的AmOctβ2R受体后发现，其对双甲脒和DPMF的敏感性要比瓦螨的同源受体VdOctβ2R分别低16和6倍，表明靶标不敏感性是导致蜜蜂对双甲脒产生抗性的主要原因。通过进一步的同源建模，分子对接和序列对比分析，作者发现三个位于双甲脒结合口袋位置的，但是在蜱螨和蜂科中氨基酸序列不一样的位点。把蜜蜂AmOctβ2R中的这三个位点的氨基酸替换为瓦螨VdOctβ2R中对应位点的氨基酸后（E208V, I335T, I350V），这个突变体（AmOctβ2RV3X）对双甲脒的敏感性提高了3倍，同时内源性配体章鱼胺的反应保持不变（图2）。为了进一步在活体验证这三个氨基酸的重要性，通过在Octβ2R敲除背景的果蝇上分别表达AmOctβ2R, AmOctβ2RV3X和VdOctβ2R这三个外源基因，行为学实验表明尽管三者都可以恢复果蝇对双甲脒的敏感性，但是表达VdOctβ2R和AmOctβ2RV3X的果蝇都要比表达AmOctβ2R的果蝇对双甲脒更加敏感，说明仅仅替换三个氨基酸就足以增加杀虫剂对蜜蜂的毒性。

图2 Octβ2R受体的三个氨基酸突变可以让蜜蜂对双甲脒更敏感

蜜蜂是最常见的授粉昆虫，无论是对生态环境还是农业生产都至关重要。人类驯养蜜蜂已经有上千年的历史，但是最近十几年来全世界范围内出现了一种蜂巢里的工蜂突然消失的现象，蜂群也随之崩解，所以这种现象也被称做“蜂群崩溃综合征”（colony collapse disorder）【4】。尽管目前还不清楚导致蜂群崩溃综合征的确切机制，但取食蜜蜂脂肪体并传播残翅病毒（deformed wing virus）等病原的狄斯瓦螨被认为是其中最主要的因素【5, 6】。当前蜂农主要依靠化学防治来对付瓦螨，但因为螨虫和蜜蜂都属于节肢动物，绝大部分杀虫剂在杀死瓦螨的同时也会毒死蜜蜂，所以只有如双甲脒等极少数药物可以在蜂巢安全使用【1】。该研究揭示了双甲脒对蜜蜂和瓦螨的选择性毒力的分子机制，一方面有助于害虫的抗性监测和管理，更重要的是有助于筛选对授粉昆虫更加安全的杀虫剂，比如很多具有杀虫活性的植物精油特异性地作用于章鱼胺受体，值得进一步的开发和应用。

浙江大学农学院黄佳教授为论文的通讯作者，博士生郭磊为第一作者，硕士生范昕雨，博士后乔小木和加州大学圣巴巴拉分校的Craig Montell教授也参与了本研究。感谢北京大学饶毅教授，浙大医学院龚哲蜂教授，农学院黄健华研究员，生研院王立铭教授在果蝇品系上的帮助；动科院郑火青副教授提供的瓦螨材料；医学院田引军博士，药学院胡雪萍博士在实验技术上的指导。特别感谢浙大农学院王晓伟教授对论文的宝贵意见。

原文链接：

https://elifesciences.org/articles/68268

制版人：十一

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