全基因组测序 对不明原因的复发性流产人群来说 有检测的必要吗？

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复发性自然流产

流产(pregnancy loss or miscarriage)指的是在胎儿存活之前妊娠终止，是产科最常见的妊娠并发症。根据其发生频率，流产分为散发性流产和复发性流产（recurrent pregnancy loss，RPL）。因RPL为频率描述性疾病，不同国家和地区的妇产科学学会对其定义不尽相同。

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）也叫复发性胎儿丢失（recurrent pregnancy loss，RPL），为与同一性伴侣连续发生3次或3次 以上并于妊娠 28 周前的胎儿丢失。近年来逐渐放宽标准。这个定义在不同时期、不同国家略有不同。美国生殖医学协会（American Society for Reproductive Medicine，ASRM）、国际辅助生殖技术监测委员会（International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology， ICMART）和 WHO 将 复 发 性 自 然 流 产（recurrent spontaneous abortion，RSA）定义为 ≥2 次发生在妊娠 20 周之前的自然流产。其中最常见的类型是发生在早期妊娠的早期妊娠丢失(early pregnancy loss, EPL)。

早期妊娠丢失

虽然对术语没有达成共识，但有研究认为更倾向于使用EPL，一些国家性组织将其描述为早期妊娠时不能存活的宫内妊娠，早期妊娠是指从末次月经至孕12+6周。但至少有1个组织使用孕10周作为临界值，因此难以比较各项研究。EPL包括胚胎或胎儿无心脏活动的妊娠和有空孕囊的妊娠，后者有时称为无胚胎妊娠。

以前使用的术语包括自然流产(miscarriage或spontaneous abortion)、萎亡孕卵(blightedovum)和稽留流产(missed abortion)。这些术语没有明确标准化，不一定能表达出临床决策所需的信息，而且有时互换使用，所有这些都造成了患者的困惑。一项研究纳入145例讲英语、因早期妊娠EPL接受治疗的美国女性，发现她们更倾向于使用miscarriage和EPL，而不是早孕失败(early pregnancy failure)或spontaneous abortion，她们认为后两者不那么明确。

中期妊娠的早期妊娠丢失

中期妊娠的早期妊娠丢失(early second-trimester pregnancy loss)是指在孕13+0周之后、20+0周之前发生的妊娠丢失。20孕周这个临界值较随意，并且与<20孕周和>20孕周的妊娠之间的任何生理差异无关。中期妊娠的早期妊娠丢失或死胎占妊娠的2%-3%。感染经常是主要或次要因素。

而中国指南虽未降低对流产次数的要求，但将时间放宽至妊娠 28 周内 2-4次。根据不同标准，欧美报道的RPL 发生率仅在1%~5%，而我国并无大规模流行病学数据。

RSA的病因

RSA病因复杂多样，并缺乏特异性临床表现。虽然RPL在各个国家与学会之间的定义不尽相同，但是临床医生对 RPL 病人筛查的病因是一致的，主要包括遗传因素、子宫解剖结构异常、抗磷脂抗体综合征（antiphospholipid syndrome，APS）、内分泌或代谢异常、感染因素、免疫功能异常、血栓前状态、孕妇的全身性疾病及环境因素等。

胚胎染色体异常是造成流产的主要原因，染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）发现，在早发流产病人中，44%的流产组织发生染色体异常。但每次妊娠均为独立事件，研究显示，与散发性流产相比，RSA病人流产组织染色体异常的发生率降低，并且，末次妊娠流产物染色体异常的RSA病人再次妊娠后的累积活产率明显高于流产物染色体正常的RSA病人，这提示仅仅由胚胎染色体异常导致流产的RSA患者再次妊娠后发生流产的几率低于预期。但不能说明孕妇自身或夫妻双方进行的遗传学检测是“无用”，其目的在于分析流产原因，发现染色体/基因异常的携带，便于遗传咨询、产前指导/诊断、或胚胎植入前遗传学检测等。

特发性复发性流产

经过详细的检查，排除上述病因，仍有约50%的RSA病人无法明确病因，称为特发性或不明原因复发性流产(idiopathic or unexplained RPL, uRPL)。uRPL人群病因不明确，只能提供经验治疗，但无法获得满意的治疗效果。女性年龄(尤其妊娠年龄＞35岁)和流产发生次数是uRPL病人再次发生流产的两个独立危险因素。

多项多中心、随机对照研究表明，药物对于预防uRPL病人妊娠后流产的再次发生、增加活产率的治疗是无效的。这些药物有孕激素，单独使用阿司匹林、低分子肝素或两者合用，重组人粒细胞集落刺激因子。uRPL的发生会增加病人夫妇双方的心理压力、引起身心疲惫不堪，若能提高RPL 病人的病因明确诊断率，针对相应病因进行治疗，则对病人夫妇的帮助是巨大的。

研究对象

在山东大学附属生殖医院（山东省立医院生殖中心）就诊的RSA病人。

病人纳入标准为∶

1. 病人夫妇连续发生2次或2次以上的孕早期(孕12周前)临床妊娠自然流产，排除输卵管妊娠、人工流产和葡萄胎；
2. 外周血常规G显带核型示，病人夫妇均为正常核型(46，XX；46，XY)；
3. 经超声、子宫输卵管造影、宫腔镜或宫腹腔镜联合检查，无子宫解剖结构异常及获得性异常(慢性子宫内膜炎、内膜息肉，子宫肌瘤)；
4. 无APS及自身抗体阳性；
5. 基础内分泌、促甲状腺激素及血生化检测，无内分泌及代谢性疾病(多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常、糖尿病等)。

共纳入从 2004-2015年收集的 1024 对 uRPL 病人夫妇，平均流产次数为2.55±0.97(2-8)次，女性病人平均年龄为30.38±5.15(19-46)岁。

研究方法

应用低深度WGS对uRPL病人外周血DNA测序。应用DNA nanoarray-sequencing平台(Complete Genomics，Inc．Mountain View,CA)以双末端测序(paired-end sequencing)的方式进行测序。

3份样本(收集时间在2004-2006年)测序结果不能满足质量控制而未行数据分析，因此本次研究队列最终包含 1011 对(98.7％)uRPL夫妇。

研究结果

在1011对uRPL病人夫妻样本中，共2022份外周血样，在48对夫妻中发现了49例染色体重排，22例染色体易位携带者、27例染色体倒位携带者，另外发现了1例致病CNV、5例可能致病CNVs。WGS为RPL夫妻的遗传学病因的检出率额外增加了4.8％。

22例染色体易位断裂位点均通过 Sanger 测序得到验证。 通过仔细对比uRPL 病人初始的常规G显带核型，14例平衡易位在显带核型中得到确认，8例染色体异常(隐匿性易位)不能通过核型分析发现。电话对22位病人就诊后妊娠情况随访，结果显示病人就诊后均有后续妊娠事件发生，但是多位病人再次发生孕早期自然流产。

(笔者注：足以说明染色体核型技术本身分辨率的限制、技术人员核型分析能力的不同等原因造成了这部分患者的“漏检”。但是这种漏检率在染色体核型正常报告中的比例是多少？可能是具有相当比例的，因此需要注意“染色体核型报告提示正常核型”的患者存在“假阴性”的可能，必要的情况下，行WGS检测。PS.平衡易位断裂位点无法通过全外显子组测序(WES)获得，WGS也无法精准判断复杂的基因重排的断裂位点。)

22例染色体易位携带者，如下表

27例染色体倒位携带者，如下表

WGS在26对uRPL病人夫妇中检测出27例倒位，5例倒位涉及染色体片段长度为12.6-30.1Mb，22例倒位涉及染色体片段长度为512.5kb-7.2Mb，结果见表1-2（uRPL_10853与uRPL_20853为一对夫妻）。在5例涉及片段>10Mb的倒位中，4例能在高分辨显带核型中得到确认。

在13例（68.9%，13/19）涉及片段大于1Mb的倒位中，倒位片段含有至少1处重组热点或者至少1处断裂位点位于重组热点，提示在配子形成过程中，如果染色体倒位环发生交叉互换，形成含有部分染色体片段缺失或重复的配子的可能性增加，从而造成流产或新生儿畸形。在对病人后续妊娠情况随访时，几乎所有受访病人有过妊娠史，并成功生育，但有一对夫妇依旧发生多次孕早期流产。

6例CNVs携带者

WGS 检测出6例ACMG归类为致病或可能致病的CNVs，携带者除了表现为RPL外，没有其他表型。在本次研究中，没有确切的证据将这些CNVs与RPL的病因联系，但是WGS的发现对病人后续妊娠可能有临床指导意义。例如，某女性病人在Xq22.3q23染色体区域发现了8.1Mb的微缺失，而这一区域包含有collagen of basement membrane，alpha-5 chain（COL45）在内的多个基因，这些基因的突变或功能缺失会在男性患者中引起严重表型即Alport 综合征，从而可能导致胚胎/胎儿死亡。本次研究中发现的CNVs结果，有助于理解基因在胚胎致死性中的作用，对CNVs在RPL病人中的病因学研究提供帮助。

总结

建议联合WGS技术与常规染色体核型分析技术去明确RPL病人的遗传学病因。WGS能够发现常规G显带核型分析不能发现的低于分辨率的易位及人为忽视的易位，也能在显带核型分析报告为平衡易位的病人中发现复杂易位，为病人后续治疗提供临床指导；常规G显带补充检测WGS不能发现的罗氏易位。

局限性

除了人群限于山东地区外，未想到明显的局限性。论文中运用了Sanger、FISH、CMA、高分辨率显带技术等技术去验证WGS技术的准确性，很好！

参考文献：

2019年，山东大学，博士论文，《全基因组测序在扩大诊断复发性流产人群染色体异常病因的应用》