一石三鸟：中心法则全解析——单细胞水平多组学分析

撰文 | 考拉王的桉树

责编 | 兮

新技术的发展使得高通量精细测定单细胞的表型成为可能，使得在复杂组织中解析细胞类型和状态变得更加容易。虽然单一模式的测量已经为表型分析提供了丰富信息，但能够检测来自单个细胞多维信息的新技术也在飞速发展【1,2】。多模态方法可以将稀疏的综合测量结果与已知细胞类型和状态的直接可靠的测量结果结合起来。例如 cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-seq) 和 RNA expression and protein sequencing (REAP-seq)，利用寡核苷酸标记的抗体，将相对稀疏的scRNA-seq信号与高度丰富和特征良好的表面蛋白检测结合，实现更加可靠的细胞类型识别【3-5】。然而，mRNA和蛋白质都是基因表达的产物，对它们的检测还并不足以解释潜在的基因调控机制。

对于染色体结构的检测，scATAC-seq是一种广泛用于获取全基因组范围染色质可及性、活性转录特征和转录因子结合图谱的方法。已有数种同时捕获mRNA和染色质可及性的单细胞测序方法，有助于将染色质可及性与基因表达联系起来，并在稀疏的ATAC-seq数据上对mRNA表达数据分层【6】。但目前还没有将蛋白质标记和染色质可及性结合起来用于精确定义细胞类型和细胞状态的方法。

近日，来自美国纽约基因组中技术创新实验室的Peter Smibert 团队在Nature Biotechnology上发表题为Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells的研究长文，作者开发了一种能够同时检测染色质可及性和蛋白水平的方法——ASAP-seq（ATAC with Select Antigen Profiling）。在文章的审稿过程中，作者又开发了一种新方法：DOGMA-seq，能够从同一细胞中多模态分析染色质可及性、基因表达和蛋白质，真正实现单细胞水平多组学分析。

开发和验证ASAP-seq

为了开发ASAP-seq同时分析单细胞染色体可及性和蛋白水平，作者建立了mtscATAC-seq方法【7】，这是一种基于液滴的scATAC-seq方法，可以联合分析固定细胞中染色质可及性和mtDNA。作者对该方法进行改进，利用大量现有的商品化偶联寡聚核苷酸的抗体，设计了一种用于蛋白质检测的分子桥联方法。如下图b所示，在最初的扩增循环中，一条3 '末端封闭的短核苷酸作为模板来延伸抗体的标签，随后延伸产物与beads上的条形码寡聚物配对，与染色质可及性片段一起扩增。因为每个抗体上的寡核苷酸只能桥联一次，而且每个桥联ODN具有unique bridging identifier(UBI)序列，因此可以对蛋白进行定性和定量分析。另外，由于该实验条件下线粒体DNA也得到了保留，因此能够同时三模态分析mtDNA突变、蛋白质水平和染色质可及性。

ASAP-seq可揭示骨髓中细胞状态和细胞谱系

鉴于ASAP-seq的多模态分析可以高通量解析人体组织细胞的表观基因组、蛋白质组学和克隆特征（利用mtDNA突变），作者利用ASAP-seq检测了一个24岁健康志愿者的骨髓单核细胞，并与先前的骨髓CITE-seq参考数据比对【8】，实验结果表明，利用染色质可及性和蛋白质数据的多模态分析，可以很容易地解析骨髓细胞的状态，而mtDNA突变信息可以用于细胞谱系示踪。随后，作者又利用ASAP-seq分析了造血干细胞分化过程中表面蛋白的动态变化。

ASAP-seq和CITE-seq揭示三个层次的调控

ASAP-seq和CITE-seq分别结合高通量蛋白质测定和表观遗传或转录蓝图，作者推测共有的蛋白特征可以帮助连接scRNA-seq 和 scATAC-seq数据集，作者同时应用ASAP-seq和CITE-seq研究了T细胞激活后的表观遗传、转录组和蛋白质组的变化。实验结果表明结合ASAP-seq和CITE-seq，可以在单细胞分辨率上区分基因调控的三个层次的变化。

DOGMA-seq能够实现四模态共测量

在本文审稿过程中，10x Genomics公司发布了“Multiome”产品，可以从同一细胞中同时捕获转录组和染色质可及性。作者意识到ASAP-seq是可以与该试剂盒兼容的，新方法将可以分析从染色质可及性到mRNA表达，再到蛋白质水平的整个基因调控过程，实现中心原则的全解析，因此作者将该方法称为DOGMA-seq。为了验证DOGMA-seq的可行性，作者利用DOGMA-seq重复了T细胞激活实验，结果表明该方法能够跨越中心法则分析染色质可及性、mRNA和蛋白质水平，通过改变实验条件，还可以选择性获取mtDNA基因型。随后作者还通过阵列CRISPR-Cas9筛选策略，利用靶向扰动探究了T细胞活化过程中染色质和蛋白水平变化的潜在机制。

ASAP-seq可以检测细胞内蛋白

为了探究ASAP-seq对胞内蛋白检测的潜力，作者对胞外和胞内蛋白标记两类不同标签，两个标记库可以独立扩增并具有可调节的测序深度，用于同时检测和定量细胞内和表面的抗原。结果表明ASAP-seq可以实现细胞内和表面蛋白检测和定量，从而促进生物学相关免疫表型和细胞状态的精细注释。

小结

本文作者提出了一种独特的ASAP-seq方法，能够同时检测数千个单细胞中的蛋白质丰度、染色质可及性和mtDNA突变，由于桥联标签的引入，可以使用现有商品化抗体偶联物，是一个可用的、易于上手的实验方案。此外，ASAP-seq还可以直接检测和定量细胞质和细胞核内的蛋白质。进一步结合10x Genomics试剂盒开发的DOGMA-seq技术，能够同时分析单细胞中染色质可及性、mRNA和蛋白质水平，并可选择性检测mtDNA基因型。总之，ASAP-seq和DOGMA-seq可以作为模块化和强有力的工具绘制单细胞中基因和蛋白质调控的复杂相互作用的图谱。

值得一提的是，两项同样可以同时检测蛋白丰度和染色质可及性的工作也以预印版的形式发表，分别命名为TEA-seq 【9】和PHAGE-seq【10】。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-00927-2

制版人：十一

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