“老药新用”，利托那韦纠正肌张力障碍小鼠

撰文 | 易

责编 | 翊竑

肌张力障碍（dystonia）是主动肌与拮抗肌收缩不协调或过度收缩引起的以肌张力异常的动作和姿势为特征的运动障碍综合征，具有不自主性和持续性的特点。依据病因可分为原发性和继发性。原发性肌张力障碍与遗传有关。继发性肌张力障碍包括一大组疾病，有的是遗传性疾病（如肝豆状核变性、亨廷顿舞蹈病、神经节苷脂病等），有的是由外源性因素引起的（如围生期损伤、感染、神经安定药物）。在所有形式中，肌张力障碍是仅次于帕金森病和特发性震颤的第三大最常见的运动障碍。

DYT1（DYT-TOR1A）是一种特别严重的早发性肌张力障碍形式。通常是在儿童早期发生，一旦症状出现，就会持续不断，造成大量的累积残疾。目前，没有耐受性良好和高效的口服治疗药物，通常情况下，需要在专门的三级保健中心采取侵入性方法来充分控制症状，例如肉毒杆菌毒素注射和深部脑刺激。因此，具有改善疾病症状的口服药物的鉴定将改变当前的治疗格局。

2021年8月18日，美国杜克大学Nicole Calakos在Science Translational Medicine期刊上发表题为 The HIV protease inhibitor, ritonavir, corrects perse brain phenotypes across development in mouse model of DYT-TOR1A dystonia 的论文，在DYT1早发性全身性肌张力障碍模型上，基于hTorsinA错误定位，通过前期开发的高通量高内涵方法在NCATS药物库的2816种化合物中，鉴定到ritonavir（利托那韦），一种HIV蛋白酶抑制剂，可以纠正模型小鼠多种脑表型异常，表明ritonavir是具有改善肌张力障碍的强力候选药物。

DYT1 TorsinA蛋白的错误定位倾向已在跨多个细胞系统的多项研究中观察到。ΔE TorsinA错误定位倾向也被观察到，并与蛋白质是否表达为融合蛋白无关。基于野生型和ΔE hTorsinA蛋白定位的这种差异，作者在前期已开发了一种高通量、高内涵的检测方法，并成功应用于全基因组RNAi筛选。在本研究中，作者筛选了包含2816种药物的NCATS库，发现了18种化合物符合设定的标准。其中一种HIV蛋白酶抑制剂（HIV protease inhibitor, HIV PI）ritonavir（利托那韦）较为引人瞩目，因为它的已知靶标不存在于检测细胞系中，而蛋白质稳态和综合应激反应（ISR）中描述的脱靶机制与肌张力障碍发病机制进程相关。经过一系列确证实验，与细胞毒性实验筛选后，ritonavir仍然是表现最好的化合物之一。

图1. CellTiter-Glo (CTG)检测不同化合物处理对细胞活力的影响

图2. Ritonavir对DYT1 hTorsinA错误定位及细胞数量的量效曲线

通常，多巴胺通过 2 型多巴胺受体（D2R）导致强直性纹状体胆碱能中间神经元（striatal cholinergic interneurons, SCIs）活性降低。然而，在DYT1小鼠模型及其它几种模型中，SCI对D2R激动剂的反应是放电率增加而不是降低，表明SCI失调可能是肌张力障碍更常见的特征。在本研究中，作者使用模拟人DYT1肌张力障碍基因型的敲入小鼠（Tor1a+/ΔGAG）测试了ritonavir在体外急性应用于脑切片的作用。在盲态下将急性脑切片与溶剂或ritonavir一起预孵育1至4小时，进行SCIs的细胞附着记录以评估D2R激动剂（quinpirole）调节的放电率。结果表明，与溶剂对照组相比，ritonavir显著改变了D2R SCI反应。SCI内在兴奋性的测量表明，ritonavir的作用可能是通过改变动作电位动力学、减慢和加宽动作电位波形来发生的。这些结果说明，脑组织在体外急性暴露于ritonavir足以使与肌张力障碍相关的D2R SCI病理生理正常化。

进一步，作者测试了ritonavir在全身和慢性给药条件下的作用。因为早期发育是小鼠和人类广泛髓鞘形成和微结构发育的时期，作者选择早期发育窗口用ritonavir进行治疗，以测试ritonavir对大脑微结构的影响。结果表明，ritonavir对小鼠进行早期围产期治疗会导致与DYT1基因型相关的脑微结构缺陷的长期正常化。连同神经生理学结果，动物模型研究显示ritonavir在不同治疗条件下对DYT1模型小鼠的矫正作用，对体外治疗的急性反应和在离散的围产期窗口中长期给药后持续的成年期影响。

最后，作者解析ritonavir发挥作用的分子机制。首先，检查了8种FDA批准的HIV PI和一种相关类似物（cobicistat）是否具有类似效果，发现这9种HIV PI中只有5种减少了ΔE hTorsinA错误定位，表明ritonavir的活性被许多但不是所有的HIV PI共享。并且，作者发现这5种药物中，只有ritonavir显示了具有最好的效果且最轻的细胞毒性。由于这些HIV PI开发用于抑制病毒编码的蛋白酶，在本文使用的细胞中没有表达，说明ritonavir具有的肌张力障碍治疗效果来自于其脱靶机制。整合应激反应（integrated stress response, ISR），一个高度保守的生化途径，可在细胞应激源以及学习和记忆环境中广泛调节eIF2α的蛋白质合成。作者发现ISR活性有助于ritonavir的作用。

总之，在这项研究中，作者使用开发的检测DYT1 hTorsinA错误定位的高通量高内涵筛选方法，从含2816种化合物的NCATS药物库中，鉴定了ritonavir，一种HIV蛋白酶抑制剂，可以纠正成熟大脑中的纹状体胆碱能中间神经元生理机能，并在离散的早期发育窗口期间提供扩散张量磁共振成像信号的持续纠正，且其功效与ISR激活相关。这些临床前结果将ritonavir确定为具有改善肌张力障碍症状的候选药物。