星星“荧”火乱，知其组装来

撰文 | 岑十

图1. Alpha-4 GFP nanovesicles TIRF成像

当你看到这幅图，你是否会联想到夜空中的点点繁星呢？2019年7月，来自美国肯塔基大学的Christopher I. Richards团队在Analytical Chemistry杂志上发表一篇题为Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging的文章。该文章使用单分子荧光成像技术并结合微囊泡分离技术，首次实现了对活体动物受体组装的体外观察。文章揭示了尼古丁处理可以诱导小鼠神经系统中烟碱型乙酰胆碱受体的上调以及受体亚基组装的化学计量上的变化，且受体组装的改变在不同脑区中表现不同。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.9b02133

那么，他们如何通过星星“荧火”之图（图1）来揭示受体组装的神秘面纱的呢？首先，我们就需要简单地聊聊什么是单分子技术。

浅述单分子技术

经典的生物技术方法通常是对样品整体进行观测，观测结果代表了一个群体的平均状态。然而，单个分子的活动状态可能与集体的平均水平差异较大，因此对大量分子集中观测可能会使我们难以捕捉生物化学发生进程中分子的中间状态或者不同内环境和生理状态下分子的活动的变化。单分子技术提供了记录某群体中单个分子运动状态的方法，可以实时观测单一分子随时间的动态变化。通俗来讲就如图2所示，当马在奔跑状态下，我们无法得知马的运动方式，但对单匹马的运动进行连续记录，可以帮助还原和理解马是如何运动的。单分子技术就可以实现对单个分子在时间序列上的连续记录，单分子技术为研究生物分子的结构，组装，转运，分子间相互作用和功能等提供了强有力的工具。

图2. 马的运动[1]

单分子技术大致可以分为两类：

1. 研究生物系统对所施加的张力或扭转力等外力的响应，可以使用原子力显微镜[AFM]、光镊[OT]、磁镊[MT]等技术[2]。

2. 通过对单个分子的荧光标记进行成像观察。

聊完单分子技术，回到文章利用单分子荧光成像技术解析受体组装的问题上，值得一提的是该文章涉及的实验方法于2021年5月分享在Bio-protocol上，题为Single-Molecule Studies of Membrane Receptors from Brain Region Specific Nanovesicles。下面，我们就一起来看看具体的技术路线吧。

原文链接：https://bio-protocol.org/e4018

微囊泡分离结合单分子荧光成像

技术路线

●1. 点亮星星——标记目标物●

实现对目标物进行成像观察，首先需要进行荧光标记。作者通过α4-GFP敲入的小鼠实现了对烟碱型乙酰胆碱受体亚基的标记。标记方式除了文章中涉及的融合荧光蛋白，还可以通过荧光染料，抗体标记等。荧光标记需要遵循几个原则：（1）荧光亮度高；（2）吸收和发射光在可见光范围内；（3）具有光稳定性；（4）荧光分子小，不干扰目标物；（5）可与目标物共价结合[3]。

●2. 手摘星辰——微囊泡分离与固定●

活体成像由于复杂的组织结构和低光透过性具有很大的挑战。为了观察特定内环境的受体组装，作者巧妙的采用了微囊泡分离的方式实现了活体受体组装的体外观察。通过超高速梯度离心得到的囊泡可以保留原位的细胞膜，分离90-150 nm可以基本确保每个囊泡是单个受体。接下来通过在成像玻片上包被anti-GFP的抗体从而将含有α4-GFP的乙酰胆碱受体固定在玻片上(图3)。

图3. 微囊泡的固定

●3.坐观星象——单分子荧光成像●

单分子荧光成像常用的技术手段包括全内反射荧光显微镜(TIRF)和荧光共振能量转移(FRET)，另外还有基于超分辨技术的光激活定位显微技术/随机光学重建显微技术(PALM/STORM)[4]。文中作者使用TIRF进行了荧光漂白成像。当照明激光的入射角大于样品与界面的临界角时，实现全内反射照明(图4)。全内反射产生的倏逝波随距离呈指数衰减，导致界面附近的激发深度限制在100-200 nm。全内反射照明可以通过消除离焦发射光来显着提高信噪比，并通过使用受限的照明量来降低光毒性[5]。

图4. 全内反射[6]

●4.解密“荧火”——荧光漂白数据分析●

回到开篇的“夜空星星”图，我们对某一荧光亮点分析其荧光随时间的变化曲线图，可以看到荧光漂白呈阶梯式下降。通过下降的阶梯个数进而推断亚基的组成（图5 D,E）。

图5. α-4 GFP微囊泡单分子成像

该技术提供了一种广泛的膜蛋白活体状态的体外观察方法，对于膜蛋白的功能研究具有重要的意义。