王华婷、孙昊研究组联合构建骨骼肌干细胞体内编辑系统

成体骨骼肌干细胞（muscle stem cell）也被称为卫星细胞（satellite cell，SC），在骨骼肌损伤修复中起关键作用。通常情况下， SC前体细胞形成于出生前两天左右的小鼠胚胎中，它们在小鼠出生后不断增殖分化形成肌肉，这一生长时期被称为幼年肌肉生长期（postnatal myogenesis）【1】，这些活跃增殖状态的细胞也被称为幼年期SC（juvenile SC）。在小鼠出生后2-4周，这些细胞的增殖结束，回归静息状态成为成年小鼠的备用干细胞（Quiescent SC， QSC）。在健康的成年小鼠骨骼肌中，这些QSC位于基底膜下，特异性表达Pax7转录因子，但是当肌肉受到损伤刺激后，会诱导表达肌肉特异性转录因子MYF5和MYOD1，快速激活并进入细胞周期。这些激活的SC（activated SC，ASC）也被称为成肌细胞 (myoblast)。其后，成肌细胞大量增殖，降低Pax7的表达进一步分化融合形成新的肌纤维。同时，部分成肌细胞会维持Pax7的表达并返回到静息转态以维持SC数量【2】。

近年来，CRISPR/Cas9已被广泛用于各种小鼠模型的构建以及治疗各种遗传疾病【3】。在肌肉系统中，通过腺相关病毒 (adeno-associated virus，AAV)介导的递送，CRISPR/Cas9已被成功用于治疗杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy ，DMD)。鉴于AAV有限的转载能力（＜4.7 kb），通常情况下Cas9和sgRNA需要被装载到不同的AAV载体中，因此只有同时接收到二者的细胞核才能被编辑，这也直接限制了编辑的效率。另一方面，这些编辑多是发生在肌纤维中，而SC尤其是QSC能否被CRISPR/Cas9编辑有待进一步的研究。

2021年9月16日，香港中文大学王华婷研究组与孙昊研究组在Stem Cell Reports上联合发表题为CRISPR/Cas9/AAV9-mediated in vivo editing identifies MYC regulation of 3D genome in skeletal muscle stem cell的研究论文。该文构建了一个能够对SC进行体内编辑的系统，并利用该体系揭示转录因子MYC可通过影响三维基因组调控SC的激活。

首先，为了便于在体内编辑SC，研究人员构建了可在SC中表达Cas9的小鼠（Pax7Cas9）。Cas9的表达并未对SC的数目、肌纤维的大小以及骨骼肌的损伤修复产生明显的影响。接下来，研究人员在处于活跃状态的juvenile SC中验证CRISPR/Cas9的编辑效果。为此，研究人员选择Myod1作为范例，利用AAV9将sgRNA通过肌肉注射的方式递送到出生10天（postnatal 10，P10）的Pax7Cas9小鼠中。在注射4周后，分选出的SC中MYOD1的蛋白水平显著降低，当AAV9-sgRNA的剂量高于1×1011 vg时，Western已检测不到MYOD1蛋白表达。进一步的测序发现，编辑效率最高可达95.08%。研究人员又进一步测试了双sgRNA的编辑效果，在相同剂量下，双sgRNA的编辑效率要略高于单个sgRNA。这些充分证明CRISPR/Cas9可以高效编辑juvenile SC。

其后，研究人员进一步验证CRISPR/Cas9是否能够编辑处于静息状态的QSC。为此，他们构建了可在SC中诱导表达Cas9的Pax7ER-Cas9小鼠。相较于Pax7Cas9小鼠，在Pax7ER-Cas9小鼠中Cas9的表达可通过他莫昔芬（Tamoxifen，Tmx）控制，从而将CRISPR/Cas9编辑限制在QSC中。研究人员采取了3种不同的策略，但遗憾的是均未能有效编辑QSC。

接下来，研究人员进一步将该系统用于编辑其他SC中的关键转录因子（key transcription factor，key TF），以探究它们在SC中的功能。已有的研究证明【4】，关键转录因子的表达受到超级增强子（super enhancer，SE）的调控，而关键转录因子又可结合到超级增强子上调控其功能。利用这一特性，研究人员首先在SC中分别预测了一系列可能调控SC静息以及激活的关键转录因子。作为其中一个因子，Myc被编辑后，其蛋白水平明显降低，编辑效率高达83%。功能上，Myc编辑导致SC的激活显著降低，而骨骼肌损伤修复也被显著抑制。最后，研究人员又进一步探讨了MYC调控SC激活的潜在机制。通过Hi-C，研究人员发现Myc编辑导致三维基因组明显改变，同时伴随着基因表达水平的改变，暗示MYC可能通过调控三维基因组进而调控基因表达，从而影响SC的激活。

总而言之，这项研究首次揭示了CRISPR/Cas9/AAV9-sgRNA系统可以高效编辑处于活跃状态的juvenile SC，但不能编辑处于静息转态的QSC。该系统可用于编辑研究SC中调控因子的功能。相较于传统的构建基因工程小鼠的方法，该系统大大降低了体内敲除特定基因所需要的时间和精力，尤其是需要同时敲除多个基因时，该系统更具优势。另外，不仅仅是编码基因，该系统也可用于非编码基因功能的研究。

香港中文大学化学病理系博士后何良强，博士生丁英哲，矫形外科与创伤学系博士后赵喻（现为中山大学副教授）是该研究成果的共同第一作者。矫形外科与创伤学系王华婷教授与化学病理系孙昊教授是该论文的共同通讯作者。

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