韩春雨被冤枉了吗？最新研究表明NgAgo具有核酸内切酶活性

2016年，韩春雨以通讯作者在《Nature Biotechnology》上发表了标题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的论文。其称相比较于Cas9-sgRNA，NgAgo-gDNA不需要PAM序列，具有更大的优势。此文一出，便引起国内外极大的关注。但此后国内外多个实验室均表示无法重复韩春雨的NgAgo实验，从此韩春雨便陷入造假风波，这就是著名的NgAgo事件。那NgAgo到底是否具有核酸内切酶活性呢？

来自普渡大学KevinV.Solomon团队的最新研究结果表明，可溶的而不是重新折叠的NgAgo蛋白确实具有切割DNA的核酸内切酶活性。该研究中，作者通过鉴定DNA切割所需的残基及其切割位点来证明NgAgo确实是一种能够切割DNA的核酸内切酶。虽然NgAgo的作用机制仍有待阐明，但作者提供的证据表明，这种活性对于通过同源重组修复且由NgAgo介导的基因编辑至关重要，该成果发表在《Nucleic Acids Research》上。

NgAgo具有典型的N端、PIWI、MID和PAZ结构域，以及一个推定的单链DNA结合(repA)结构域

为了研究NgAgo蛋白，作者预测并分析了NgAgo的蛋白序列及结构。由于NgAgo蛋白表达量极低，且易形成包涵体，因此作者以MjAgo（最相似的古菌pAgo）为模板，构建NgAgo的蛋白结构。预测的NgAgo结构类似于MjAgo的晶体结构，由典型的N端、PAZ、MID和PIWI结构域组成（图1A和B）。此外，作者还发现一个结合单链DNA的OB结构域，并认为该结构域是repA。

可溶的而不是重折叠的NgAgo在体外表现出DNA切割活性

由于嗜盐蛋白的序列适应性使其在低盐环境中往往不溶，这给体外研究NgAgo带来困难。作者从可溶的和不溶的部分中纯化了野生型NgAgo，以测试5P-ssDNA引导依赖的DNA裂解，并使用既定方法在纯化过程中重新折叠不溶性NgAgo。从可溶部分(sNgAgo)中纯化的NgAgo在不需要引导的情况下能够切割质粒DNA和基因组DNA，产生带切口和线性化的质粒。然而从不可溶部分纯化的NgAgo经重新折叠后几乎没有DNA酶活性。

NgAgo的RepA和PIWI结构域参与DNA切割

为了排除非特异的细胞核酸酶污染的可能性，作者进行了NgAgo的无细胞表达。这种方法已成功用于其他核酸内切酶的研究，包括CRISPR-Cas核酸内切酶。NgAgo在存在5’磷酸化的gDNA的情况下进行诱导表达，其中gDNA靶向质粒底物pNCS-mNeonGreen（图2A、B）。然后在开始蛋白表达后添加NaCl以促进嗜盐酶的正确折叠（图2C）。为了鉴定NgAgo切割DNA的关键区域，作者构建并表达了NgAgo的repA结构域，一个没有repA结构域的截短的NgAgo（N-del）和D663A/D738A点突变的全长蛋白质（图2D）。实验结果表明，只有在同时存在repA缺失和PIWI突变（Ndel/D663A/D738A）的情况下，切割DNA的活性才会完全消失（图2E）。当与提供的gDNA没有互补性的非目标质粒与酶一起孵育时，仍然能观察到线性化产物（图2F），这表明NgAgo能产生特异的和非特异的DNA切割。

NgAgo特异切割与gDNA互补的DNA

为了验证通过NgAgo引导的序列特异性切割，作者对图2E中线性切割产物进行测序。测序结果表明，用野生型NgAgo处理的目标质粒的产物中有20507个读数，在反向(RV)向导的3端下游1bp处被切割（图3B）。而在其他NgAgo突变体中，切割产物的丰度要低得多，且大部分切割位点不在靶标位点处，这很可能是由于gDNA不匹配或化学损坏导致的低水平脱靶的结果（图3B）。因此，该实验表明，NgAgo确实能够在gDNA的引导下特异切割靶标DNA。

在细菌中NgAgo对质粒和基因组位点具有特异活性

接下来，作者尝试检测NgAgo能否在体内切割靶标DNA。这里作者选择大肠杆菌而不是哺乳动物细胞作为研究模型，因为NgAgo与大多数pAgo一样，缺乏分离DNA链以进行pAgo识别和互补序列切割所需的解旋酶活性。作者创建了一个双质粒系统，它在一个质粒上包含一个可诱导的NgAgo表达盒，另一个作为一个目标，其中包含一个转录失活的假基因目标，mNeonGreen，以及在选择性条件下的选择性标记或必需基因cat（图4A）。NgAgo在含有这两种质粒的细胞中表达，并将靶向不同mNeonGreen链的磷酸化的单链gDNA(P-ssDNA)转化至该细胞中（图4B）。当表达NgAgo且存在gDNA靶向转录沉默的mNeonGreen时，相对于未引导的对照，观察到的菌落形成单位不到一半（图4C）。为了确认NgAgo不仅只作用于质粒上的靶位点，作者还针对基因组位点arpB进行靶向敲除。实验结果表明，靶向arpB确实降低了存活率（图4C），这表明NgAgo也能切割基因组DNA，这与作者靶向切割质粒的结果一致。

结论

NgAgo是一种新型DNA核酸内切酶，是一种由特征repA结构域定义的未被识别的pAgo类。NgAgo使用PIWI中保守的催化四分体和新的未表征的repA结构域来切割DNA。在原核生物中能够通过NgAgo切割DNA介导基因编辑。作者的工作建立了探索NgAgo活性（以及其他pAgo的活性）的创新方法，并确定了将其开发为下一代生物学工具的关键蛋白质特征。

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab757/6363767

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