eLife丨如何用光操纵单个细胞中的基因活动？

神经细胞像电路一样连接在一起，通过刺激神经细胞能够影响动物的行为和运动。研究人员使用各种工具来研究线虫、果蝇和斑马鱼等模式生物中的神经网络。诀窍是激活一些神经细胞，而不是其他神经细胞，以便隔离它们在神经回路中的特定作用。为此，常用的方法是通过组织特异性启动子作用于靶向细胞群，如UAS/Gal4系统。然而，这种方法只能提供有限的精确度，并且在许多情况下没有合适的启动子；特别是在研究人员旨在将表达限制在单个细胞或定义的细胞子集的情况下。

该研究中，作者发明的LaserTAC系统可利用光操纵单个细胞（如神经元）中的基因活动。该方法通过构建光笼版本的酶Cre重组酶来实现，当细胞用紫外线照射时，一部分氨基酸被去除，从而使Cre重组酶打开其目标基因。这使研究人员能够精确控制特定基因在哪些细胞中以及何时开启或关闭。此外，随着遗传密码扩展效率的提高，该技术还可用于修饰除Cre重组酶以外的蛋白质，并应用于近年来开发的其他人工氨基酸，该研究成果发表在《eLife》上。

优化ncAA（非经典氨基酸）的参入

得益于遗传密码扩展（genetic code expansion），研究人员能够在翻译过程中将一些功能引入蛋白质，这些功能是常规的、天然存在的氨基酸所不具备的。通过表达特定的氨酰-tRNA合成酶(aaRS)及其特异识别的tRNA来实现的，其中tRNA上带有确定非规范氨基酸(ncAA)的掺入位点的密码子。有效的遗传密码扩展取决于氨酰-tRNA合成酶氨酰化其同源tRNACUA的能力，后者反过来将 ncAA 传递到核糖体，以响应 UAG 琥珀终止密码子（图 1A）。

图1. 遗传密码扩展和 LaserTAC

来自古细菌Methanosarcina物种的正交吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)/tRNA(Pyl)对是最通用和广泛使用的遗传密码扩展对。该研究中，作者采用一个吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的变体--PCKRS，并通过基因改造在其N端加入一个强出核信号（S-NES），使其大量停留在细胞质中，因为蛋白质的合成在细胞质中。为了测定PCK掺入效率，作者使用了双色掺入传感器；普遍表达的GFP::mCherry融合，两个荧光团编码序列由琥珀终止密码子（UAG）分隔（图2B）。不存在光笼赖氨酸（PCK）时，翻译将在琥珀终止密码子处终止，导致仅产生GFP。相反，在存在PCK的情况下，tRNA(Pyl)CUA带有ncAA并充当无义抑制因子，从而产生全长GFP::mCherry融合蛋白。实验结果表明，所有检测的NES都使PCKRS从细胞核输出到细胞质（图2D）。其中，PKIα-NES和Smad4-NES大大提高了PCK的掺入效率（图2C），因此作者选择了这两个最有效的PCKRS变体用于后续实验。同时，作者还优化了tRNA(Pyl)，作者发现C15变体的存在显著提高了掺入效率（图2C、E、F和G）。

图2. 使用 NES::PCKRS变体和tRNA(C15)提高了秀丽隐杆线虫中遗传密码扩展的效率

光笼化Cre重组酶的表达及优化

作者接下来改造Cre重组酶，Cre 重组酶可以通过用PCK（光笼赖氨酸） 替换 K201（该赖氨酸对Cre酶活性至关重要）进行光笼化，获得表达光笼化Cre重组酶(PC-Cre)的线虫品系。在没有光照的情况下，该Cre没有活性；当经365 nm光照后，PCK上的部分基团丢失，Cre被活化（图3A, B, C）。激活的Cre能够切割基因组上的两个loxP位点，是目的基因前的终止子丢失，从而激活目的基因的表达（图3C）。作者构建了包含所有LaserTAC系统所需遗传成分的转基因品系：优化的PylRS/tRNA对Smad4-NES::PCKRS/tRNA(C15)、PC-Cre和Cre靶标基因ChR2::mKate2。作者从L1幼虫阶段开始，将幼虫放在含PCK的培养基上培养，并在它们达到L4幼虫阶段（2天后）时通过紫外线照射激活PC-Cre（图3A）。激活后24小时，作者看到ChR2::mKate2在表达PC-Cre的神经元中强烈表达。为了进一步改进光活化方法，作者接下来转向PC-Cre优化。为此，作者通过引入点突变使内部NLS序列失活，同时还去除N端SV40NLS。为了仅恢复全长PC-Cre的入核效率，作者将线虫强EGL-13如何信号太附加到Cre的C末端，获得优化的PC-Cre(optPC-Cre)（图3E）。当作者将optPC-Cre与PC-Cre进行比较时，作者确实发现目标基因激活得到了显著改善：从PC-Cre的63%到optPC-Cre的97%（图3D）。

图3. 优化 PC-Cre 重组酶以在线虫中实现遗传密码扩展

使用LaserTAC激活特定细胞的基因表达

通过光来控制Cre重组酶的活性应该允许对依赖于Cre的DNA重组进行精确的空间控制。作者通过使用安装在显微镜上的365nm激光靶向触摸响应回路中的单个细胞，以此来测试LaserTAC激活基因表达的精度。线虫有六个机械感觉神经元，用于感知软触摸：AVM、ALML和ALMR，位于蠕虫的前部，以及PVM、PLML和PLMR，位于蠕虫的后部（图4A），触摸感受器神经元的激活导致回避行为。12-24小时后，作者观察到仅存在于激光靶向细胞中的Chrimson::mKate2表达。作者能够在两个PLM神经元以及单独的PLML或PLMR中选择性地激活optPC-Cre（图4C-E）。

图4. 使用优化的光笼化Cre重组酶的LaserTAC促进了线虫特定细胞中光遗传学通道的表达

总结

综上所述，这些发现表明，LaserTAC系统可用于利用光操纵单个细胞（如神经元）中的基因活动。它使研究人员能够精确控制特定基因在哪些细胞中以及何时开启或关闭。此外，随着遗传密码扩展效率的提高，该技术可用于修饰除Cre重组酶以外的蛋白质，并应用于近年来开发的其他人工氨基酸。

原文链接：

https://elifesciences.org/articles/67075

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