惊奇！RNA聚合酶能够复制DNA

T7 RNA聚合酶( T7 RNAP )是一种来自T7噬菌体的简单的单亚基酶，它能够驱动高度活跃的DNA转录，其RNA合成速度是大肠杆菌RNAP的数倍。它从T7启动子(PT7)处启动高度特异的DNA转录，且该酶在体外、不同原核和真核细胞等一系列条件下都具有强大的功能。它也可以用作融合蛋白来重新编程启动子序列的特异性，将额外的活性聚集到转录起始位点，或作为一种分裂蛋白来实现光开关。这些特性使其在生物技术、基础研究和合成生物学、体内和体外环境中发挥重要作用，尤其是在基因过表达方面。虽然体外研究表明，T7 RNA聚合酶(RNAP)和T7 DNA聚合酶（DNAP）对DNA复制的起始至关重要，但在生物体内仅依赖于T7相关功能的质粒复制尚不清楚。

最近，研究人员通过改造T7ori质粒，在没有任何已知质粒ori且没有噬菌体感染的情况下，使该质粒能够在表达T7 RNAP的大肠杆菌宿主中复制，这进一步扩展了T7 RNAP作用的范围。该研究通过提供一种需要T7 RNAP进行复制的新型质粒来帮助选择最佳遗传工具，该研究发表在《Nucleic Acids Research》上。

构建依赖T7ori进行DNA复制的质粒及菌株

为了开发可以仅使用T7ori在大肠杆菌中复制的质粒及菌株，作者构建了一个测试方案（图1A）。作者采用需要RepA进行复制的pSC101核心原点，并构建了多个测试质粒及菌株，如表1。

表1. 测试质粒及菌株

作者将repA插入E.coliJM101的染色体中，获得菌株JM101repA。pCKO1质粒包含repA和pSC101ori.JM101T7m菌株，缺少repA，但能表达T7复制所需的四个蛋白（RNAP、DNAP、HelPrim和ssDNAbp）。pTestOR包含核心pSC101ori和T7ori，pT7-OR（T7oriplasmid）仅含T7ori。将pTestOR转化至JM101T7m菌株的转化效率极低，将pT7-OR转化至JM101T7m菌进行补救获得JM101T7c菌株后，将pT7-OR转化至JM101T7c菌株的效率能恢复至与pCKO1质粒相当的转化效率。

将不同质粒转化至不同菌株中，作者得出结论，T7ori质粒可以在大肠杆菌菌株中复制，这个过程可能取决于部分或全部整合的T7基因（图1）。

图1.T7ori质粒的构建

表征T7ori质粒

为了确定T7ori质粒的哪些顺式元件对成功复制很重要，作者在克隆菌株JM101repA中组装了一系列pTestOR质粒的变体，并在JM101T7c中测试了它们的复制。作者反复观察到pT7-OR（以及pTestOR）的“丢失”并保留了抗生素抗性，这可能是由于质粒重组到测试菌株的基因组中。因此，作者去除了pT7-OR的两个区域，这些区域可以允许同源重组到大肠杆菌的内源基因组中，获得pT7-ORs质粒。然而，虽然它比pT7-OR更稳定，但作者注意到即使pT7-ORs在40到50代后也会丢失。因此，作者将JM101T7c[pT7-ORs]培养了50多代，并分离了pT7-ORs的突变版本。该突变质粒可以在JM101T7c中在具有抗生素选择的丰富培养基中重复繁殖80多代，而不会获得任何进一步的突变，该质粒被命名为pT7_ori_1。

T7衍生功能对JM101T7c中T7ori质粒复制的重要性

接下来，作者研究了哪些元素在反式复制中是必不可少的。具体来说，作者想检查是否需要整合到JM101染色体中的所有四个T7基因。作者对JM101T7c染色体上的四个T7基因进行了测序，发现所有T7基因都获得了自发突变，其中T7 RNAP突变为RNAP-Q737P。为了确定这些突变何时出现，作者对亲本菌株JM101T7m进行了测序，发现它携带与JM101T7c相同的T7基因突变，这表明即使没有T7ori质粒，T7基因也可能对大肠杆菌造成负担。

为了阐明T7衍生基因突变版本的功能重要性，作者构建了单敲除衍生物（图2A）。唯一不能复制pT7_ori_1质粒的菌株是JM101T7cΔrnap。作者发现，当用表达T7 RNAP-Q737P的质粒转化该菌株时，JM101T7cΔrnap中pT7_ori_1的复制可以得以恢复，但表达野生型T7RNAP的质粒则不能。这表明JM101T7c中T7ori质粒的复制只需T7中的T7RNAP-Q737P，这也表明，在JM101T7c 的T7ori质粒的复制过程中，大肠杆菌的复制机制可以替代T7 DNAP、HelPrim和ssDNAbp的功能。

作者接下来检查了T7 RNAP中Q737P突变的重要性。首先，作者将染色体上的突变基因恢复为野生型序列，获得菌株JM101T7c_RNAPwt。在用pT7_ori_1转化该菌株后，作者无法获得菌落，这表明该突变对于pT7_ori_1的成功复制至关重要。

接下来，为了探索Q737P替换的可能影响，作者构建了质粒pEGC，其中包含受T7/lacO融合启动子控制的GFP基因（图2B）。实验结果表明，T7 RNAP-Q737P的产生水平较低，与野生型T7 RNAP相比，其活性改变或降低，或半衰期缩短。总的来说，这突出了RNA聚合酶活性的变化与成功复制T7ori质粒的能力之间的相关性，但确实暗示了一种机制上的关联。

进一步确定T7ori质粒复制中T7的关键功能

该研究中还存在一个疑问，用T7 ori质粒转化JM101T7c比转化其亲本菌株JM101T7m的效率高呢？为了解释这个现象，作者将JM101T7c和JM101T7m菌株的基因组进行测序，看是否能够找到相关功能的突变。最终，作者找到两个突变菌株JM101T7c2和JM101T7c3。有趣的是，获得两个新菌株的全基因组序列并随后对所有四个菌株的序列进行比较显示基因rnhA是单一的共同突变宿主基因。作者得出结论，不同的突变最有可能导致由rnhA编码的核糖核酸酶H(RNaseHI)蛋白质活性降低或完全丧失所致。

为了验证rnhA在T7ori质粒复制中的作用，作者用pT7_ori_1和表达RNAP的质粒pT7RNAP-Q737P（图3A）转化了BW25113和BW25113rnhA菌株。与之前的观察一致，pT7_ori_1的有效转化仅在BW25113的rnhA变体中实现，并且仅在T7 RNAPQ737P存在的情况下实现。对BW25113菌株中T7ori质粒复制所需的所有元件的成功重新设计也证实了作者的发现并非特定于给定的大肠杆菌菌株，并且作者已经正确识别了所有必需的功能元件。

总结

作者发现了广泛使用的T7 RNAP的新功能——质粒复制，该功能需要在核糖核酸酶 H失活的条件下才能实行。该功能可被应用应用于基因表达，这得益于一种诱导剂的两种效应：增加基因剂量以及增加重组基因的转录。由于T7 RNAP已被证明在许多领域都具有价值，这表明Tori质粒从基础科学到合成生物学的许多潜在应用。

原文链接：

https://academic.oup.com/nar/article/49/14/8189/6320377

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