乙酰磷酸介导cAMP受体蛋白的乙酰化调控分枝杆菌的毒力

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作者：狄玉昌，徐思悦，迟明哲，胡酉炜，张潇，王洪海，张文宏，张雪莲

第一作者及单位：狄玉昌 复旦大学遗传工程国家重点实验室/生命科学学院/上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室/国家传染病医学中心

通信作者及单位：张雪莲，张文宏 复旦大学遗传工程国家重点实验室/生命科学学院/上海市传染病与生物安全应急响应重点实验室/国家传染病医学中心

研究背景

结核分枝杆菌（MTB）作为结核病的病原体，其巨噬细胞内“成功”生存，部分归功于它对宿主的动态和恶劣微环境（如低pH、低营养和缺氧等）的感知及反应能力。其中利用环磷酸腺苷（cAMP）作为第二信使来感知和应对各种外部环境就是分枝杆菌应对宿主环境的重要机制之一，cAMP可通过结合并激活cAMP受体蛋白（CRP）来传递信号。CRP被认为是一个参与MTB代谢、感受NO及毒力等相关至少约100个基因调节的全局调节子，然而以往研究主要集中在CRP蛋白对靶基因转录水平上的调控，分枝杆菌如何调控CRP自身活性并调控下游靶基因的分子基础并不完全清楚。本文研究发现分枝杆菌通过代谢产物AcP调节CRP蛋白193位赖氨酸（K）的乙酰化修饰来调控CRP活性进而影响下游靶基因的转录并调控分枝杆菌毒力的机制。

研究方法

1.体外评价K193位点乙酰化修饰对MTBCRP结合DNA能力的影响

（1）构建并纯化MTB CRP WT，K193位点突变蛋白（CRPK193Q模拟乙酰化蛋白，CRPK193R模拟非乙酰化蛋白，CRPK193A无侧链蛋白）及定点乙酰化修饰蛋白（CRPK193Ace）；（2）将可结合CRP蛋白的DNA探针进行生物素标记，利用凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)检测CRPK193位点模拟（去）乙酰化及定点乙酰化修饰对其DNA结合能力的影响。

2.评价分枝杆菌菌体内K193位点（去）乙酰化修饰状态对下游靶基因转录的调控作用、对分枝杆菌生长和应对不利环境能力的影响

（1）为探究乙酰化修饰对菌体内CRP功能的影响，构建了耻垢分枝杆菌（MSM）基因组CRP编码基因K193位点定点突变菌株（Msm-CRPK193Q和Msm-CRPK193R）；（2）评价CRPK193（去）乙酰化修饰对其下游靶基因转录水平的影响；（3）评价CRPK193（去）乙酰化修饰对耻垢分枝杆菌生长的影响；（4）探究CRPK193（去）乙酰化修饰对细菌应对不利环境胁迫能力的影响。

3.评价K193位点（去）乙酰化修饰对分枝杆菌胞内生存和毒力影响

（1）评价CRPK193（去）乙酰化修饰不同状态的菌株侵染巨噬细胞和胞内复制能力差异；（2）通过小鼠感染实验评价CRPK193（去）乙酰化修饰不同状态对分枝杆菌毒力的影响。

4.探究CRPK193位点可逆乙酰化修饰的调控机制

（1）构建海分枝杆菌及结核分枝杆菌影响AcP产生的敲除株(Mma-△ackA，MTB-△ackA) 和NAD+依赖去乙酰化酶编码基因敲除株（△Rv1151c） ；（2）菌体内、外评价CRPK193乙酰化和去乙酰化的调控机制。

研究结果

1.CRP的K193乙酰化修饰影响其DNA结合能力：相比野生蛋白，CRP蛋白K193位点突变为谷氨酰胺（CRPK193Q，模拟乙酰化）完全丧失了其结合靶DNA的能力，然而突变为精氨酸（CRPK193R，模拟非乙酰化）对其结合DNA能力并没有明显的影响（图1a）。同时无侧链丙氨酸突变蛋白（CRPK193A）结合DNA能力不变，提示赖氨酸侧链对于CRP与DNA结合的能力不是必需的，支持K-to-R和K-to-Q突变体之间不同的结合能力是由于K193的类似于不同乙酰化状态的不同电荷导致的。用NƐ-乙酰赖氨酸体外表达系统制备K193定点乙酰化蛋白（CRPK193Ace）（图1b），进一步确认CRPK193Ace蛋白不能结合靶DNA（图1c），确证了K193乙酰化修饰导致CRP结合靶DNA能力丧失。

图1 K193位点乙酰化影响CRP的DNA结合能力 (a) CRPK193位点突变蛋白的DNA结合能力。(b)体外表达 K193定点乙酰化蛋白（CRPK193Ace）。(c) CRPK193Ace的DNA结合能力。

2.K193乙酰化修饰调控分枝杆菌CRP下游靶基因的转录：与Msm WT相比，模拟K193完全乙酰化的Msm-CRPK193Q染色体突变菌株导致CRP自身及其下游靶基因的转录明显减少（减少30%~50%），而模拟完全去乙酰化状态的Msm-CRPK193R菌株下游靶基因转录水平增加3~5倍（图2）。结果进一步证实K193的乙酰化降低了CRP结合靶DNA能力，且K193乙酰化状态抑制靶基因的转录，而完全去乙酰化状态可增强它们的转录。

图2 CRPMsm (MSMEG_6189)及其靶基因在CRP突变菌株中的转录水平。*：P<0.05， **：P<0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001

3.K193的乙酰化修饰减弱分枝杆菌的生长和抗逆能力：与野生株相比，Msm-CRPK193Q和Msm-CRPK193R染色体突变株都延迟了Msm的生长，相比Msm WT 38小时进入静止期，Msm-CRPK193R和Msm-CRPK193Q分别在42和46小时后才进入静止期（图3a），说明CRPK193的完全（去）乙酰化状态均不利于分枝杆菌的生长。CRPK193不同乙酰化状态同样影响分枝杆菌的抗逆能力，Msm-CRPK193R菌株在不同压力下的存活率均明显高于Msm WT（大约0.5 lgCFU）（图3b-3g）。然而除H2O2（5mM）和SDS（0.05%）条件外，Msm-CRPK193Q的抗压力能力显著下降，在低pH条件下，Msm-CRPK193Q的存活细胞数从8.0 lgCFU明显下降到4.7 lgCFU，在缺氧条件下为4.1 lgCFU，热处理后为6.2 lgCFU（图3d-g）。

图3 K193的乙酰化修饰影响分枝杆菌的生长和抗逆能力 (a) 突变株在7H9-OADC培养基中的生长曲线。(b-g)突变株在0.05% SDS (b)、5mM H2O2 (c)、缺氧(d)、低pH 3.5 (e)和低pH 4.5 (f)、热处理(g)等不同胁迫条件下的生存能力。*：P<0.05， **：P<0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001

4.cAMP及不同环境压力调控分枝杆菌CRP K193的乙酰化修饰水平：分枝杆菌能否通过感知外界环境变化直接调控CRP K193可逆的乙酰化修饰进而影响CRP的活性？研究定制CRPMTB K193乙酰化的特异性抗体并检测在不同压力和cAMP条件下菌体CRPK193位点的乙酰化水平，发现Msm暴露在不同的压力下导致CRP的表达增加，K193位点的乙酰化水平下降（图4a）。随cAMP浓度增高，K193的乙酰化减少，而CRP蛋白的表达增加（图4b）。综上表明，生理状态下的CRPWT不会保持完全的（去）乙酰化，分枝杆菌可以感知cAMP的水平和不利的环境条件，通过CRP K193可逆的乙酰化修饰来动态地调节CRP的活性进而调控细菌自身的生存。

图4 cAMP及不同环境压力调控分枝杆菌CRP K193的乙酰化修饰水平 (a)不同胁迫条件下CRP蛋白表达水平和K193乙酰化水平。(b)不同浓度cAMP下CRP的表达及K193的乙酰化水平。

5.CRP K193的乙酰化修饰调控分枝杆菌的致病性和毒力：与野生型菌株相比，Msm-CRPK193R的侵袭率和细胞内存活率在感染后6~48小时内明显增加。然而Msm-CRPK193Q在三个感染菌株中表现出最低的细胞内存活能力（图5a）。感染C57BL/6小鼠发现，从感染后8小时到11天，完全去乙酰化状态的Msm-CRPK193R菌株在感染小鼠肺部、脾脏和肝脏的细菌载量明显高于野生型菌株，而感染完全乙酰化状态的Msm-CRPK193Q菌株的小鼠肺部和脾脏细菌载量则显著下降（图5b-f）。同时与感染Msm WT的两只小鼠在第5天和第8天死亡相比，感染Msm-CRPK193R的六只小鼠在25天的实验结束时死亡，而感染Msm-CRPK193Q的小鼠在实验过程中没有死亡（图5g）。与Msm WT和Msm-CRPK193Q感染的小鼠相比，Msm-CRPK193R感染的小鼠肺组织中的炎症浸润和肺泡壁损伤更为明显（图5h）。

图5 CRP K193乙酰化在小鼠模型中调节细菌毒力 (a)细菌在巨噬细胞系RAW264.7中的复制。(b-f)小鼠感染突变株后不同时间点不同器官的细菌载量。(g)感染小鼠的生存曲线。(h)小鼠肺部H&E染色。

*：P<0.05， **：P<0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001

6.CRP K193乙酰化修饰受分枝杆菌代谢产物AcP的调控：体外研究发现，CRPMTB可以被AcP乙酰化，且乙酰化水平随AcP的剂量和作用时间依赖性的变化（图6a）。AcP是磷酸三酯酶（Pta）-乙酸酯激酶（AckA）途径的一个中间产物，为确定CRP的乙酰化是否受体内的AcP调节，在M. marine（Mma-△ackA）和MTB （MTB-△ackA）菌株中敲除了AckA编码基因。在两种分枝杆菌的△ackA突变体和对照菌株中，以葡萄糖为碳源，△ackA敲除菌株中较高的细胞内AcP水平增加了CRP K193的乙酰化；相反，以乙酸盐为碳源△ackA菌株的AcP水平下降时，CRP K193的乙酰化都下降（图6b-g），证实AcP可以作为CRP的乙酰供体，且CRP K193的乙酰化水平与细胞内AcP浓度高低有关。

图6 CRP K193乙酰化受AcP调节 (a)CRP体外受AcP的乙酰化修饰。(b-e)不同生长阶段AcP的细胞内浓度。(f-g)不同碳源条件下野生型菌株和ackA敲除菌株中CRP的表达和K193的乙酰化水平。*：P<0.05， **：P<0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001

7.CRPK193去乙酰化受NAD+依赖性去乙酰化酶的调控：研究进一步发现CRPK193在体外和菌体内可以被NAD+依赖性去乙酰化酶（Rv1151c）去乙酰化，且在该酶抑制剂NAM存在时，Rv1151c不能有效地进行CRPK193的去乙酰化（图7a &7b）。研究还进一步发现cAMP和不同的应激条件明显增加了去乙酰化酶Rv1151c的表达（图7c&7d）。

图7 CRP K193在体外和体内均可进行去乙酰化 (a)CRP体外受Rv1151c蛋白的去乙酰化调节。(b)CRP体内受到Rv1151c的去乙酰化修饰。(c-d)不同cAMP浓度(c)和不同胁迫条件(d)下Rv1151c的表达水平

研究结论

分枝杆菌感知cAMP等环境信号可直接调控CRP K193的乙酰化；CRP K193的乙酰化修饰可导致CRP结合靶DNA能力丧失，并通过CRP K193的可逆乙酰化动态调控其下游基因的转录、改变其应对不利环境的能力，并影响细菌的致病性和毒力；且CRP K193乙酰化和去乙酰化分别受代谢产物AcP和NAD+依赖的去乙酰化酶的调控。