USP42保护ZNRF3/RNF43免受R-spondin依赖性清除并抑制Wnt信号

写在前面

今天推荐的是由德国海德堡大学有机体研究中心 (COS)在2021年3月30日发表于EMBO Reports（2021IF：9.0705，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Sergio P Acebron教授，研究表明USP42保护ZNRF3/RNF43免受R-spondin依赖性清除并抑制Wnt信号。

研究背景

肿瘤抑制因子RNF43和ZNRF3通过促进Wnt受体LRP6和Frizzled(FZD)的更替在发育和组织稳态中发挥核心作用。干细胞生长因子R-spondin诱导ZNRF3/RNF43的自身泛素化和膜清除以促进Wnt信号传导。然而，在质膜上稳定ZNRF3/RNF43的去泛素化酶仍然未知。

摘要部分

在这里，研究人员表明USP42通过保护ZNRF3/RNF43免受泛素依赖性清除来拮抗Rspondin。USP42与ZNRF3的散乱相互作用区(DIR)结合，并通过去泛素化ZNRF3来阻止R-spondin-LGR4-ZNRF3三元复合物形成。因此，USP42增加了LRP6和Frizzled(FZD)受体的转换并抑制了Wnt信号传导。此外，研究人员表明USP42在结肠癌细胞和小鼠小肠类器官中充当旁分泌Wnt信号通路的抑制物。研究人员对调节R-spondin提供了新的机制见解，并得出结论，USP42对于ZNRF3/RNF43在细胞表面的稳定至关重要。

研究内容

图1.文章研究思路

R-spondin蛋白促进E3连接酶ZNRF3/RNF43的自身泛素化和膜清除，这是Wnt信号调节的关键事件。然而，负责ZNRF3/RNF43去泛素化和膜稳定的DUB仍然未知。为了识别潜在的DUB调节ZNRF3/RNF43，研究人员使用Wnt报告基因测定(TOP flash)作为报告系统在HEK293T细胞中进行了DUB siRNA筛选，并识别出USP42USP42编码一种145kDa的蛋白质，除了其去泛素化酶(USP)结构域和预测的单核定位信号(NLS)外，没有明确的结构特征。USP42定位于细胞质、质膜和细胞核。核USP42已被证明可以去泛素化和稳定H2B，以及p53以响应基因毒性应激。通过三个独立的siRNA敲低wtHEK293T细胞中的USP42使Wnt3a诱导的TOP flash活性增加>2倍。至关重要的是，USP42的敲低并未上调ZNRF3/RNF43双敲除HEK293T细胞中的Wnt报告基因活性，表明E3连接酶对Wnt信号传导中USP42活性的要求。研究人员进一步发现USP42的敲低与Wnt报告基因检测中的四种R-spondin蛋白(RSPO1-4)协同作用，并增强了由配体-受体复合物（Wnt1/LRP6/FZD8）诱导的信号传导，但不是由β-catenin诱导的信号传导。总之，这些数据表明USP42是R-spondin和Wnt/b-连环蛋白信号传导的新型负调节剂，通过RNF43/ZNRF3在受体水平发挥作用。

研究人员接下来检查了USP42是否调节ZNRF3和RNF43泛素化。研究人员在变性条件下对ZNRF3进行免疫沉淀，发现USP42的敲低增加了其多聚泛素化。相反，USP42的异位表达消除了ZNRF3和RNF43的泛素链并导致非泛素化ZNRF3或RNF43的积累。为了探究USP42是否与ZNRF3/RNF43相互作用，研究人员进行了免疫共沉淀(co-IP)实验。GFP-USP42共沉淀ZNRF3，但不是β-destruction AXIN1的复合物。另一方面，阳性对照GFP-DVL1共沉淀ZNRF3和AXIN1。与ZNRF3的情况一样，USP42在HEK293T细胞中的异位表达抑制了由四种R-spondin蛋白(RSPO1-4)中的任何一种诱导的Wnt报告信号。重要的是，催化失活突变体USP42 C120A的表达不抑制Wnt报告基因活性。最后，研究人员生成了USP42 KO HEK293T细胞，其在Wnt3a处理后显示出比亲本细胞更高的TOP flash激活。重要的是，USP42 KO诱导的Wnt活性被RNF43/ZNRF3或USP42的异位表达阻断，但不被USP42 C120A阻断。USP42通过去泛素化ZNRF3和RNF43在Wnt信号中发挥作用。

图2.USP42使ZNRF3去泛素化并抑制Wnt/b-连环蛋白信号传导

受体转换ZNRF3/RNF43自身泛素化促进其从膜转换。为了评估USP42是否直接在质膜上稳定ZNRF3/RNF43，研究人员进行了细胞表面蛋白生物素化测定。USP42的表达减少了质膜上ZNRF3和RNF43的泛素化。因此，USP42大大增加了ZNRF3和RNF43在质膜上的驻留。接下来，研究人员研究了USP42是否也保护ZNRF3/RNF43免受R-spondin的侵害。在LGR4存在的情况下，RSPO1降低了ZNRF3的蛋白质水平。重要的是，RSPO1刺激了ZNRF3和USP42 DNLS之间的相互作用，从而挽救了ZNRF3的RSPO1依赖性清除。为了进一步了解USP42对ZNRF3的调控机制，研究人员分析了ZNRF3、R-spondin和LGR4之间三元复合物的形成。如前所述，催化失活的ZNRF3（ZNRF3ΔRing）共沉淀LGR4，并且这种相互作用在RSPO3存在下得到增强。有趣的是，USP42与ZNRF3的相互作用增加了三元复合物的形成。这些结果表明ZNRF3泛素化起到R-spondin/LGR4的释放信号的作用，它允许USP42阻止三元复合物。此外，研究人员的结果显示USP42与催化失活的ZNRF3(ZNRF3ΔRing)相互作用支持额外的E3连接酶促进ZNRF3泛素化的可能性。在这方面，最近的证据表明β-TrCP是促进ZNRF3转换的E3连接酶。综上所述，这些结果表明USP42与R-spondin和LGR4形成拉锯战以控制ZNRF3/RNF43泛素化和质膜驻留。鉴于ZNRF3和RNF43在促进Wnt受体转换的质膜中的突出作用，研究人员接下来探究了USP42是否影响FZD和LRP6蛋白水平。USP42或ZNRF3在HEK293T细胞中的异位表达增加了FZD5从质膜的清除率并降低了总FZD5蛋白水平。此外，USP42与ZNRF3共同起作用以清除FZD8。最后，HEK293T中USP42的敲低增加了内源性LRP6蛋白水平，无论是在基础条件下还是在RSPO3处理后。研究人员得出结论，USP42协助ZNRF3/RNF43促进Wnt受体更新。USP42拮抗R-spondin并促进Wnt受体更新。

图3.USP42拮抗R-spondin/LGR并促进FZD和LRP6蛋白更新

RNF43/ZNRF3活性的丧失通过激活旁分泌Wnt信号与癌细胞增殖、存活和EMT相关。为了研究USP42是否也参与这些细胞过程，研究人员首先对siUSP42（数据集EV1A-B）的HCT116细胞进行了bulk-RNA测序。值得注意的是，USP42的敲低上调了肠道干细胞增殖特征中包含的45个基因中的大部分。此外，USP42的敲低下调了癌症中EMT基因特征的上皮基因和上调间充质基因（N=171个基因）。因此，研究人员探讨了USP42是否通过旁分泌Wnt信号调节细胞增殖、存活和EMT。与研究人员的RNA测序结果一致，USP42的敲低诱导了HCT116细胞的形态学变化，包括从鹅卵石样到细长表型的转变和细胞间接触的丧失，这些都是EMT的特征。EMT的一个关键事件是细胞间粘附蛋白E-钙粘蛋白的下调。HCT116细胞在其质膜上呈现高水平的E-钙粘蛋白，在使用四种不同的siRNA敲低USP42后，这些质膜被擦除。根据旁分泌Wnt信号转导对USP42活性的要求，Wnt配体分泌介质(WLS(Evi))的基因消融以及ZNRF3的异位表达挽恢复了E-钙粘蛋白水平。接下来，研究人员使用CRISPR/Cas9探究了USP42基因消融后的HCT116细胞，这导致E-钙粘蛋白水平的损失，从而表型复制siUSP42。研究人员得出结论，USP42通过抑制旁分泌Wnt信号传导来阻止HCT116细胞中的EMT。

接下来，研究人员通过集落形成实验分析了USP42是否影响细胞存活和克隆形成能力。先前的研究表明抑制Wnt分泌会降低HCT116细胞的集落形成效率。相反，USP42的敲低增加了HCT116细胞中的集落形成。与球状体生长的情况一样，用PORCN抑制剂处理、WLS(Evi)的基因消融以及ZNRF3的异位表达挽救了USP42敲低诱导的克隆形成能力。为了研究USP42是否抑制Wnt驱动的细胞增殖，研究人员进行了球体测定。研究人员在悬液滴中培养HCT116细胞长达6天，产生了约0.3 mm2的球状体。四个独立的siRNA敲低USP42强烈促进球体生长和分枝。重要的是，这种效应依赖于Wnt分泌：首先，siUSP42诱导的球状体生长被WLS(Evi)的基因消融以及PORCN抑制剂IWP-2和LGK-974。其次，ZNRF3的异位表达也挽救了siUSP42上的球状体生长。此外，使用CRISPR/Cas9对HCT116细胞中的USP42进行基因消融也增加了球状体的生长，这被LGK-974抑制了。在RKO细胞中也观察到USP42在阻止Wnt依赖性结直肠癌细胞维持中的作用。与HCT116细胞的情况一样，RKO中USP42的敲低促进了球体生长和集落形成，这被PORCN抑制剂阻断。与HCT116细胞不同，RKO细胞不表达E-钙粘蛋白并且已经显示间充质表型，与USP42敲低无关。综上所述，研究人员的数据表明，USP42通过控制旁分泌Wnt信号传导，作为结肠癌细胞增殖和EMT的抑制物。USP42是结直肠癌细胞中旁分泌Wnt信号的抑制物。

图4.USP42缺失导致Wnt依赖性增殖和EMT

结论与讨论

在这里，研究人员表明USP42保护ZNRF3/RNF43免受质膜上Rspondin和泛素依赖性清除的影响。从机制上讲，USP42与ZNRF3的散乱相互作用区(DIR)相互作用并使ZNRF3/LGR/RSPO复合体停滞。因此，USP42促进Wnt受体LRP6和FZD的周转并抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导。此外，研究人员还表明，USP42通过抑制旁分泌Wnt信号传导，作为结肠癌细胞中细胞增殖、存活和EMT的障碍。最后，研究人员报告了Usp42的基因消融赋予小鼠小肠类器官Wnt超敏反应。研究人员的工作揭示了ZNRF3和RNF43如何稳定在质膜上，并提供了对干细胞因子LGR4和R-spondin调节的机制见解。