东北农业大学单安山教授团队《ACS Nano》：具有高稳定性及多重杀菌机制的多肽自组装纳米粒子

“药当饭吃”导致“饲料禁抗”

自从抗生素被发现并广泛使用以来，抗生素滥用现象普遍，特别是在畜牧业，人们会把抗生素混入饲料中定期投喂牲畜，长期下来不仅导致动物源性食品的药物残留等公共卫生隐疾，还造就了多重耐药的“超级细菌”，对公共卫生安全造成了重大的威胁。特别是去年我国“饲料禁抗”的实行，使安全、高效的新型饲用抗生素替代产品的研发成为当前饲料工业急需攻克的重大课题，是我国饲料产业的发展方向。

抗菌肽（Antimicrobial peptides）是一类存在于生物体内的天然小分子多肽，通过静电相互作用与细菌细胞膜进行作用并实施溶菌等抗菌手段，拥有杀菌速率快、无残留和不易产生耐药性等优势，在饲料、食品和医药等领域具有广阔的应用前景。然而当抗菌肽饲用（口服）时，在消化道内易被蛋白酶降解，制约了其有效性。

多策略大杂烩巧设计

近日，东北农业大学动物营养研究所单安山教授团队报道了一种结合抗酶解肽单元（Arg-Pro），树状大分子结构和纳米尺度的自组装技术，利用氨基酸和分支链之间的双重空间位阻，设计开发出在生理环境下可自发组装并具有超高稳定性的多肽纳米颗粒。与以往多肽聚合物难于上青天般的制备截然不同的是，该纳米粒子通过固相合成单体肽后，仅需在生理环境下利用尾部棕榈酸提供的疏水作用力驱动的自组装来简易制备，制备的多肽纳米颗粒尺寸在5-45 nm之间。

图1 多肽自组装纳米粒子的单体肽合成及自组装表征

抗菌活性及稳定性

图2多肽自组装纳米粒子的抗菌活性及稳定性

该多肽自组装纳米粒子展现了强大的广谱抗菌能力，对检测的9种细菌均展现出高效的抑菌活性，其中C₁₆-3RP纳米粒子的最小抑菌浓度（MIC）几何平均值低至2.16 µM。对7种生理浓度的盐离子表现出极强的稳定性，并可抵御模拟肠胃液中胰蛋白酶和糜蛋白酶长达8小时的水解作用。该研究突破了多肽类抗菌素不宜饲用（口服）的理论难点，为多肽类抗菌素在动物养殖中替代饲用抗生素使用及口服给药途径提供了先进理论与关键技术。

生物相容性及体内治疗效果

图3 多肽自组装纳米粒子的体外及体内相容性

研究者通过检测多肽自组装纳米粒子对人红细胞及人胚胎肾细胞（HEK293T）等正常组织细胞系的毒性，发现经64 µM的C₁₆-3RP纳米粒子处理后，溶血率仅为10%左右，HEK293T细胞的存活率大于90%，而这一浓度约是其几何MIC值的30倍。此外，研究者还探究了C57BL/6小鼠在注射最高剂量为40 mg/kg的C₁₆-3RP纳米粒子后的活动情况、体重变化、肝肾毒性指标及各器官的病理切片，结果表明C₁₆-3RP纳米粒子展现出极佳的体内生物相容性。

图4 多肽自组装纳米粒子的体内治疗效果

研究者进一步通过小鼠急性腹膜炎模型探讨了C₁₆-3RP纳米粒子的体内治疗效果。在使用致死浓度的大肠杆菌感染1小时后，仅通过单次10 mg/kg剂量的C₁₆-3RP纳米粒子治疗后，即可通过直接的抗菌功效大量减少各器官细菌载荷和强力的炎症控制对抗细菌感染引起的器官损伤，对小鼠急性腹膜炎引起的感染展现出良好的治疗作用。

多肽自组装纳米粒子的杀菌机制

为了揭示多肽自组装纳米粒子的杀菌机制，研究者用革兰氏阴性大肠杆菌ATCC25922和C₁₆-3RP纳米粒子进行杀菌研究。一系列的荧光标记及显微镜试验结果显示C₁₆-3RP纳米粒子首先通过静电吸引相互作用与大肠杆菌表面的LPS相结合，快速吸附到大肠杆菌表面，增大外膜通透性，并穿透外膜到达质膜，使质膜去极化进而破坏质膜完整性，导致细菌内容物外漏，从而导致细菌死亡。通过转录组学探究发现C₁₆-3RP纳米粒子还通过抑制细菌核糖体生物合成、氨基酸代谢和能量产生等途径杀死细菌。该研究首次观测到了多肽纳米颗粒与细菌相互作用过程的高清图片，并结合原核转录组学数据提出多肽纳米颗粒多重作用机制的观点，为多肽抗菌作用机理的深入研究提供了新的见解和方向。

图5 多肽自组装纳米粒子的杀菌机制

总结：研究者结合多学科知识，通过一种简单且通用的策略巧妙地设计合成了具有广谱抗菌能力、优异稳定性和优良生物相容性的多肽自组装纳米粒子。凭借破坏细菌细胞膜活性，抑制细菌核糖体生物合成、氨基酸代谢和能量产生等多重机制，多肽自组装纳米粒子快速有效的杀灭细菌，并且不易诱导细菌抗性，对饲用（口服）多肽类抗菌素的开发有着重要的启示作用。该研究成果以题为“Self-Assembling Peptide Dendron Nanoparticles with High Stability and a Multimodal Antimicrobial Mechanism of Action”的论文发表在《ACS Nano》上。通讯作者为东北农业大学单安山教授，第一作者为单安山教授课题组的来振衡博士研究生。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c03301

来源：高分子科学前沿

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