未来液相色谱还能担得起蛋白质变体分离的工作吗？

一开始我们认为人类基因组的近2万个蛋白质编码基因和所表达的蛋白质数量有着密切的联系。

但是现在认为这个观点是错误的，因为通过各种新的检测技术，包括质谱，预测人类基因组中可能有25万~100万个蛋白质。

那么这和色谱有啥关系呢？

其实，一个多世纪以来，液相色谱在发现、鉴定和定量测定组成生命系统的成分上发挥了极其重要的作用。

而液相色谱是会继续发挥作用还是如质谱社区用户所言，将会成为历史呢？我们将在此文中探讨这个问题。

首先，什么是蛋白质变体

我们知道，在蛋白质合成过程中，蛋白质编码基因为一个由小的、紧密相关的结构及结构亚型提供了母版，其合成的调节变化涉及选择性剪接和超过200种转录后修饰(PTM)。

它的过程可能会导致一个由100个成员组成的蛋白变体家族中许多成员在生物学功能上存在差异。人类基因组通过这种方式获得了更多的蛋白质编码基因。

Smith 和Kelleher在2013年提出将这些结构的亚型命名为“蛋白质变体”（Proteoform）。

蛋白质变体的复杂性如何预测这些高水平变性蛋白的复杂性是很重要的问题。

这一想法产生于对从色氨酸消化系统中提取的多肽中的分裂变点和大量的PTMs的识别，通常由质谱对完整的蛋白质进行自上而下的序列分析来支持。

通过气相离子去识别位点和蛋白质的初级结构修饰类型是很有价值的，但它必须协同体内蛋白质变体的结构、功能和它们之间的相互作用分析。因为蛋白质变体存在于液体环境，所以这种结合分析是必要的。

我们通常认为，蛋白质的发现，分离和鉴定技术已经高度发达。而实际上，大约只有不到10万的人类蛋白质被分离和鉴定。如果预测蛋白变体数是准确的，那么只有不到一半的蛋白变体已经被分离和鉴定。蛋白质分离效率低，需要在分离技术上取得突破。

分离技术探讨在各类的液相色谱中，能出峰的蛋白质不超过几百种。假设从有100万种组分的混合物中出峰的可能有1000种蛋白质，那么多维分离法是一种明显有效的方法，但是对一个200×200的片段进行综合结构分析将发现蛋白质变体非常复杂。

这一直是一个问题，显然，粒径，理论塔板数，峰容量调整也不能解决这个问题。

此外，离子交换色谱法，疏水作用色谱法，反相液相色谱和固相金属亲和色谱法的选择性差，只有结构完全不同的蛋白质才能被分离。

更深层次的探讨，解决这个难题似乎还是有可能的。

同一个基因能编码出许多具有相同结构特征的不同种蛋白质变体，能够识别这些共同特征的固定相能捕获蛋白质变体家族；理论上，如果能再深入一步，就可以将100万个组分减少到小于100个组分，这将具有巨大的意义。

只有目标物和少数有关的非特异性蛋白被保留，其他的非目标物都会被除去。在这种情况下，当前的液相色谱分离柱的选择性对单一的特征结构是有用的。根据其结构特征对蛋白质变体进行分类。此外，自顶向下的高分辨的质谱可以识别同类蛋白质变体结构差异和非特异性蛋白。

如何获取高选择性固定相

最大的问题是如何获取这种对结构选择性高的固定相。

令人惊讶的是，它们已经存在了。

有一种固定化的多克隆抗体（pAb）对蛋白质的多个特征表位进行了检查，让该家族中所有蛋白质变体的共同特征识别和选择成为可能。

家族特异性单克隆抗体（mAbs）也有同样的作用，但是只能识别单一的共同抗原表位。

利用现有家族的任何一种蛋白变体作为免疫原，可以产生一种多克隆抗体靶向普通蛋白质组的表位。成千上万的多克隆抗体已经可以使用了。

从未被分离出来的蛋白质就会遇到更大的问题，从来没有任何一个蛋白变体可以用作免疫原。依赖抗体的蛋白质组学的新领域，通过使用蛋白质片段库来获得免疫原体来解决这个问题。

其原理是：利用编码蛋白质基因的DNA序列预测一个蛋白质家族的6-15个氨基酸片段，当它被合成并附着在一个分子量大的免疫原上时，可能将会产生能够识别这个蛋白质家族的共同抗原表位的抗体。

为了用分馏法来测定多种蛋白质的结构和功能，液相色谱法在生命科学领域的未来似乎是光明的，但在于结合性应用。显然，亲和选择器的获取和使用是一个重要的突破口。

用具有家族选择性的固定相在第一步分离中把非目标蛋白质去除，同时将目标蛋白质引入到下一步分离。幸运的是，在蛋白质分析中实现这种必要抗体的设计和生产化的方法正受到越来越多的关注。

最后，为了避免蛋白质被共价键键合固定，我们必须找到使用亲和选择器分离蛋白质的分离方法。我们需要20,000个不同的亲和选择器来实现上述目标，看上去真是难以想象。