90后教授开发新型超高分辨率显微镜，像数星星一样观察分子

撰文 | 王聪

如果要评选一个人类历史上最伟大的发明，那么显微镜一定能名列前茅。

在显微镜发明之前，人类对于世界的观察只局限于肉眼。当列文虎克使用他自制的显微镜观察到细胞和微生物后，一个全新的微生物世界在人类眼前打开。此后，恩斯特·鲁斯卡于1931年发明电子显微镜，使得人们能够直接在原子水平观察，显微镜将人类视野带到了一个之前从未触及的微观世界，人类开始对自己和自己所处的这个世界有了更深入的认知。

与显微镜相反的是望远镜，通过望远镜，我们可以观察并欣赏银河系乃至宇宙的壮丽景观。如果想更好地欣赏这些景观，最好选择一个没有月光、远离城市光污染的环境。如果在完全黑暗的情况下观察微弱的星光就容易得多。这一原理同样应用于显微镜。

2021年8月11日，浙江大学化学系冯建东研究员团队在国际顶尖学术期刊 Nature 发表了题为：Direct imaging of single-molecule electrochemical reactions in solution 的研究论文。

研究团队发明了一种可以直接对溶液中单分子化学反应进行成像的显微镜技术，并且证实了该技术可以用于活细胞的超高时空分辨成像，而且无需使用外部光源。该论文还被选为当期 Nature 的封面论文。

研究团队表示，这项利用空间分子反应定位的光学重构方法的成像技术。就像人们夜晚抬头看星星时，可以通过星星的“闪烁”将离得很近的两颗星星区分开一样。化学反应的随机性，通过空间上的发光位置定位，再把每一帧孤立分子反应位置信息叠加起来，构建出化学反应位点的“星座”。

化学反应通常涉及溶液中单个分子的碰撞。但对化学反应的测量通常记录这些分子事件集合的平均参数，单个分子反应的特征通常是模糊的，并且每个反应分子在溶液中的精确位置和时间是未知的。

经过几十年的发展，用光照射样品的方法可以说已成为“观察”单个分子的最有用的方法，基于该方法的超分辨率荧光显微镜技术也获得了2014 年诺贝尔化学奖。然而，这一方法需要使用短的、高功率的激光脉冲，它们的性能通常受到背景散射光和光漂白的限制。在生物应用中，样品也可能被强激光脉冲损坏，或产生自身荧光，从而影响了观测结果。

我们都知道，一些生物可以通过生物化学反应原位发光，例如萤火虫和一些发光水母，它们无需外部光源，却能照亮漆黑的夜空或深海。

在这项研究中，研究团队所使用的的单分子成像方法采用了类似的方法——电致化学发光。这种方法不需要任何光激发，因此可以在完全黑暗的情况下进行实验。

理论上，电致化学发光的方法的近零背景光学噪声，使其能够达到分辨率极限：检测单个分子。但目前还没有研究能够实现单分子的电致化学发光。这主要是由于单分子反应控制难、追踪难、检测难。而且单分子化学反应伴随的光、电、磁信号变化非常微弱，化学反应过程和位置具有随机性，很难控制和追踪。

为了解决这些难题，研究团队开发了一种方法，该方法可以对电致化学发光中单个激发染料分子发射的单个光子的位置进行成像，这些光子在电极表面附近触发。使用染料的稀释溶液来确保这些分子在空间上分开，当染料分子与电极产生的自由基发生反应时，就会发射光子。自由基极短的寿命确保它仅以非常高的稀释度存在于电极表面附近。因此，稀释的染料分子很少遇到稀释的自由基，以至于实验的每个毫秒持续时间快照仅捕获一个反应，因此只有一个光子。

电致化学反应单分子成像的显微镜技术

通过多个实验，该研究令人信服地表明，在不同曝光时间和不同染料浓度下，每次曝光检测到的光子数量的统计分布遵循泊松统计，从而证明染料分子与电极的碰撞是随机发生的。此外，通过分析染料浓度与检测事件之间的时间间隔之间的关系，表明该过程的速率受染料向电极表面的扩散控制。这些发现为新型显微成像概念开辟了新道路——基于化学的超分辨率显微镜。

研究团队将这种方法扩展到附着在电极上的细胞成像：细胞的粘附区域阻碍了电致化学发光反应物扩散到电极表面，阻止光子发射，从而产生这些区域的负像，生成的图像非常清晰，并与使用超分辨率荧光显微镜产生的图像相关联，验证了该方法的有效性。

图a：固定细胞的明场光学成像；图b：单分子电致化学发光成像

接下来，研究团队还将该技术应用于生物细胞显微成像，需要指出的是，该方法不需要标记细胞，从而不影响细胞状态，且成像分辨率媲美超分辨率荧光显微镜。

图a：活细胞的明场光学成像；图b：活细胞的单分子电致化学发光成像

这项新型显微镜技术将来有望为化学反应位点可视化、单分子测量、化学和生物成像等领域，具备广泛的应用前景。

这项研究成果登上了 Nature 期刊的封面，论文第一作者为浙江大学化学系博士生董金润和博士后卢禹先，论文通讯作者为浙江大学化学系冯建东研究员。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03715-9

https://www.nature.com/articles/d41586-021-02098-1