细胞外ST6GAL1调节单核细胞-巨噬细胞的发育和存活

前言：

单核巨噬细胞谱系细胞位于先天免疫和适应性免疫的交界处，我们研究证明了ST6GAL1介导的α2，6-唾液酸添加会影响越来越多的白细胞细胞表面受体，调节受体功能的例子包括延长的单核细胞TLR4炎症信号级联，Fas和TNFR1唾液酸化阻止巨噬细胞内化和随后的细胞凋亡。

重组蛋白、化学物质和细胞系

生成高度纯化的受体特异性重组糖基转移酶rST6GAL1和荧光偶联物rST6GAL1-GFP，huST3GAL1-GFP和huβ4GAL-T1-GFP，糖供体CMP-唾液酸二钠盐是从CMP-唾液酸-生物素制取的。

从ATCC获得小鼠单核细胞/巨噬细胞系RAW264.7，并用10%FBS维持在DMEM中，来自ATCC的人单核细胞THP-1细胞在含有10%FBS的RPMI中培养。

膜灌洗细胞的结合

将啤酒酵母巯基乙酸酯腹膜内注射（1mL，4%无菌溶液）以引起白细胞募集到腹膜，并在18小时后处死小鼠以收集腹膜灌洗液。

通过铵-氯化-钾（ACK）裂解除去红细胞，细胞在室温（RT）下固定在DPBS中的2%多聚甲醛（电子显微镜科学）中15分钟。

把DPBS中的固定细胞在室温下用3μg/mL重组GFP蛋白孵育30或25分钟，然后用DPBS洗涤一次，蛋白酶K消化（250μg/mL，Invitrogen）在室温下对rST5GAL6-GFP样品的等分试样进行1分钟，进行一次DPBS洗涤。

将大约2-5×10（5）个细胞施加到GoldPlus载玻片（电子显微镜科学）上用疏水笔包围的1cm点上，在室温下1小时，吸液后剩余的细胞用带有DAP的氟屏蔽安装，用于在尼康EclipseE600荧光显微镜上成像。

处理来自St6gal1KO小鼠的巯基乙酸酯募集腹膜灌洗细胞和RNA分离以检测RNA-seq

巯基乙酸酯注射液和腹膜灌洗液的制备如上所述，单核细胞/巨噬细胞从灌洗液中富集，使用磁珠去除抗体结合的B细胞，中性粒细胞，淋巴细胞和红细胞，为了制备用于RNA-seq的细胞，将耗尽的细胞群在具有10%FBS的DMEM中培养约24小时。

模拟缓冲液（0.2MNaCl，0.02MHEPES，10%甘油，pH7.2），CMP-唾液酸（100μM），重组rST6GAL1（25μg/mL），以及上述浓度的CMP-Sia和rST6GAL1的组合，3种条件均使用一式三份培养孔。

孵育24小时后，使用Qiagen的RNeasyPlus微量试剂盒通过抽吸和裂解溶液直接添加到贴壁细胞中完全除去细胞培养基以进行总RNA分离。

通过免疫荧光检测SNA反应性

RAW264.7细胞在具有10%FBS的DMEM中在无菌盖玻片上生长过夜，固定在5%福尔马林中，用唾液酸酶在2°C下处理37小时，并在2°C下单独用模拟缓冲液，CMP-唾液酸（2μM），rST250GAL6（1μg/mL）处理，或20个组合。

流式细胞术

将细胞重悬于含有1.0%BSA，05.0%叠氮化物/DPBS的02mMEDTA中，用CD16/32IgG阻断非特异性Fc受体结合，DAPI染色提供活/死细胞鉴别。

使用流式细胞仪鉴定细胞群为骨髓（BV711抗小鼠/人CD11bBioLegend#101242），巨噬细胞（PE抗小鼠F4/80BioLegend#123110）或单核细胞（PE/Cyanine7抗小鼠Ly-6CBioLegend#128018），并使用FlowJo软件进行数据分析。

选择性外切酶标记

使用SEEL方法证明了rST1GAL6对THP-1单核细胞中M-CSF-R的唾液酸化，糖基化靶标用糖供体CMP-唾液酸-生物素偶联物标记，用抗生物素IgG免疫沉淀，并通过抗M-CSF-R蛋白质印迹鉴定。

将THP-1细胞在无血清培养基中孵育2小时，然后在2°CCO中在无血清条件下处理37小时。

在含有CMP–唾液酸-生物素（100μM）和碱性磷酸酶的培养箱进行细胞裂解和免疫沉淀，用于免疫沉淀和M-CSF-R蛋白质印迹鉴定。

THP-1细胞中细胞信号传导的分析

THP-1细胞[3×10（6）/mL]在含有24.1640mMβ-巯基乙醇的无血清RPMI0中生长5小时，细胞单独用载体（模拟），CMP-Sia（10μM）和rST6G（100ng/mL）处理30分钟，然后收获，洗涤以分离总蛋白提取物或核和无核细胞质部分。

蛋白质裂解物在蛋白质印迹上运行，实验重复至少3次，将P-65和p65印迹条带归一化为各自的上样对照。

蛋白质印迹分析

在10%SDS-PAGE上分离后，将产物转移到PVDFImmobilon膜上进行前面描述的蛋白质印迹分析，简而言之，然后在含有5.170%吐温404的Tris缓冲盐水（TBS）中用0%脱脂奶粉（Bio-Rad，#1-G20）封闭膜1小时。

使用PierceECL蛋白质印迹底物检测蛋白质条带，通过将膜暴露于X射线胶片，对膜进行成像。

细胞外ST6GAL1粘附于募集的鼠炎细胞和人THP-1单核细胞的亚群

检查新鲜分离的原发性炎症细胞与外源性添加的rST6GAL1的相互作用，巯基乙酸酯用于将原发性炎症细胞募集到腹膜，在巯基乙酸盐注射后24小时内，募集的细胞主要由粒细胞组成，具有显着的单核细胞-巨噬细胞亚群。

分析贴壁细胞，避免非贴壁粒细胞的潜在污染，为了避免来自天然表达的ST6GAL1的混淆信号，使用了无法表达功能性ST6GAL1的St6gal1-null小鼠，GFP-rST6G在3分钟内附着在固定的、非透化的巯基乙酸酯诱发的腹膜细胞亚群上。

蛋白酶K消化有效地消除了GFP-rST6G信号，这进一步支持了GFP-rST6G在细胞表面上的定位，ST6GAL1对炎症细胞表面的粘附似乎是特异性的，GFP-huST3GAL1和GFP-huβ4GALT1在相同条件下不附着在炎性细胞表面。

细胞外ST6GAL1上调原代单核细胞/巨噬细胞中的基因表达

巯基乙酸酯引发后6小时从St1gal24-null小鼠收集腹膜灌洗，通过中性粒细胞，淋巴细胞和红细胞的磁珠去除富集单核细胞/巨噬细胞，然后在不存在或单独存在rST24G，单独CMP-Sia或rST6G和CMP-Sia的情况下培养6小时，仅对贴壁细胞进行体积RNA-seq分析，避免了任何残留的非贴壁粒细胞的潜在污染。

图A是RNA-seq分析热图的代表性部分，显示了响应细胞外ST6GAL1的转录谱的显着和批发变化，仅rST6G就足以引起转录谱的变化，添加的唾液酸转移酶供体底物CMP-Sia不会改变原代单核细胞/巨噬细胞的转录谱。

我们的实验无法区分涉及直接细胞表面唾液酸化与内吞作用以及返回细胞膜的受体的细胞内唾液酸化的机制，这并没有削弱外源性ST6GAL1对基因表达和细胞表型产生深远影响的关键发现。

细胞外ST6GAL1延长单核细胞存活期

来自St6gal1-null小鼠的巯基乙酸酯诱发的腹膜炎症细胞与RNA-seq研究相同，但没有基于抗体的特定细胞类型耗竭（大多数单核细胞是贴壁的，中性粒细胞通过洗涤去除）。

用rST6G和CMP-Sia一起处理细胞以测试对存活的影响，培养1天后收集贴壁细胞，并通过流式细胞术测定活细胞的数量及其表型。

rST6G和CMP-Sia将细胞存活率提高了约40%-50%，活细胞的增加主要归因于单核细胞，而常驻巨噬细胞的低比例保持不变，我们得出结论，细胞外ST6GAL1与CMP-Sia联合对单核细胞具有促生存作用。

细胞外ST6GAL1靶向细胞表面M-CSF受体的成熟形式

细胞外ST6GAL1对单核细胞/巨噬细胞转录组的显着影响促使鉴定细胞表面靶标，根据在我们观察到的对基因表达和单核细胞存活的影响中的潜在作用而选择的M-CSF受体，事实上，M-CSF-R的细胞外结构域包含9个N-连接聚糖的潜在位点。

用rST1GAL6和CMP-唾液酸-生物素偶联物（SEEL试剂）糖供体处理THP-1细胞，然后用抗生物素抗体裂解和免疫沉淀，并通过蛋白质印迹检测M-CSF-R，表面定位的成熟受体而不是前体细胞内形式的下拉显示出细胞外ST6GAL1对THP-1单核细胞中M-CSF-R的强大细胞外催化作用。

细胞外ST6GAL1启动细胞内信号传导

1. CSF-R信号传导在M-CSF/IL-34配体与其细胞外结构域结合时启动，导致受体二聚化和细胞质结构域酪氨酸磷酸化（Stanley和Chitu2014），P-AKT和P-ERK的下游形成对增殖和分化产生后果。

假设细胞外ST6GAL1对M-CSF-R的唾液酸化引发细胞内信号级联反应，最终影响基因表达和存活，因此我们评估细胞外rST6G在没有配体的情况下启动与M-CSF-R激活一致的细胞内信号传导的能力。

在THP-6细胞中评估了细胞外ST1GAL1诱导的M-CSF-R磷酸化，虽然M-CSF-R的绝对水平不受细胞外ST6GAL1的影响，但ST6GAL1引发了M-CSF-R的磷酸化，这是其激活的一个特征，并且它还增加了P-ERK1/2和P-AKT（A，中间面板）。

显著的蛋白质印迹显示，rST6GAL1与这些事件同时发生的细胞成分，这与THP-6裂解物中GFP-rST1G的存在一致。

结论：

研究的数据显示，细胞外唾液酸转移酶能够外在唾液化靶细胞表面，外源性唾液酸化由系统触发因素动态调节，这些触发因素涉及ST6GAL1介导的催化所必需的唾液酸供体底物的释放。

表明ST6GAL1结合不仅促进M2的转录激活，而且促进所有主要单核细胞/巨噬细胞/树突状细胞通路的转录活化。

升高的细胞外ST6GAL1有能力启动单核细胞分化为功能性巨噬细胞和树突状细胞的程序，弥合先天免疫和适应性免疫之间的差距。

结合循环ST6GAL1在抑制粒细胞产生的同时抑制炎症和促进B细胞成熟的其他已知相关性，我们断定循环ST6GAL1是协调从炎症过渡到更有效的免疫反应全身信号。

参考文献：

【1】BritishCM，《ST6Gal-I唾液酸转移酶对EGFR的唾液化促进EGFR活化和对吉非替尼介导的细胞死亡的抵抗力》

【2】 内梅斯，《 血源性唾液酸转移酶ST6Gal-1是造粒的阴性全身调节因子》

【3】亨内特，《唾液酸转移酶的免疫调节》

【4】艾恩斯，《系统性ST6Gal-1是小鼠过渡B细胞的促生存因子》