通过肿瘤细胞的浸润和转移导入到正常鼠肺纤维细胞进行对照

利用细胞恶性行为检测，检测鼠肺纤维恶性转化细胞-KNRL细胞的恶性程度，证实其具有肿瘤细胞的生物学行为。然后分别利用电镜技术、免疫荧光标记技术、聚丙酸胺凝胶电泳和westen印迹观察NRL和KNRL细胞的粘附结构，粘附分子表达及肌动蛋白的分布。

当时命名这种蛋白质分子为钙粘素(Cadherin)随着免疫组织化学技术的不断完善和发展，又不断有细胞与细胞间、细胞与基质间的粘附分子被发现，现已知的细胞粘附分子共分五大类即钙粘素族、免疫球蛋白超族、整合素族、选择素族和血管附着素族。进一步的研究发现，钙粘素族与其他四类粘附分子相比在细胞与细胞间的粘附中起着重要的作用。

再利用细胞培养技术对两种细胞进行培养，然后测定两种细胞的倍增时间、软琼脂培养基内细胞增殖能力、KNRL细胞裸鼠腹腔内注射，观察生长方式及病理检查，以证实KNRL细胞具有肿瘤细胞的生物学特性。然后分别利用电镜技术检查细胞间的粘附结构，细胞内肌动蛋白的分布;利用免疫荧光标记和聚丙酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Westen印迹，检测细胞粘附分子的表达和细胞内肌动蛋白的表达和分布。最后结合临床手术实践检测钙离子、温度对细胞聚集能力的影响。

KNRL细胞恶性程度检测提示，KNRL细胞的倍增时间比NRL细胞明显缩短((p<0.01).在软琼脂培养基内增殖能力明显高于NRL细胞(p<0.05)，注入裸鼠腹腔内的KNRL细胞在腹腔内呈浸润性生长并发生淋见结转移，因而证实KNRL细胞己具备肿瘤细胞的生物学特性。培养细胞光学显微镜下显示，NRL细胞呈单层生长，平行排列，极性一致。细胞大小，形态均一。细胞间紧密连接。

而KNRL细胞，部分区域细胞呈复层生长，排列紊乱，失去极性，细胞形态变为圆形或不规则型。细胞间呈松散连接，细胞间隙明显增宽。电镜下显示，NRL细胞间三种主要粘附结构一紧密连接、粘附连接和间隙连接正常存在，细胞内肌动蛋白呈均匀、平行、丝状排列。而KNRL细胞间紧密连接和间隙连接完全消失，仅存少量、点状、类似粘附连接结构存在。肌动蛋白分布明显改变，胞浆内未见到平行排列的肌动蛋白丝，而是呈不规则状，分布到细胞边缘和细胞表面突起形成的微绒毛内。

免疫荧光标记、聚丙酸胺凝胶电泳及westen印迹显示，KNRL细胞构成细胞间粘附连接的细胞粘附分子P-钙粘素、a-链蛋白、p-链蛋白表达明显异常，免疫荧光下三种分子在细胞内明显减少westen印迹显示三种分子表达完全消失。而NRL细胞，各种分子表达正常。聚丙酞胺凝胶电泳及westen印迹下，两种细胞的肌动蛋白分子表达正常。但在免疫荧光标记下，NRL细胞内肌动蛋白呈丝状平行排列，均匀分布，而KNRL细胞，平行排列消失，仅在细胞边缘形成片块状“荧光小体”。

利用t检验处理，KNRL细胞的倍增时间明显缩短，与NRL细胞相比有显著差异(p<0.05)而与LLs细胞倍增时间无显著差异(p>0.45)。分别测定10个细胞培养瓶NRL,KNRL和LLs细胞在软琼脂培养基内的增殖能力。加入钙离子后，NRL和KNRL细胞的聚集能力均增强。但x2x检验显示，NRL细胞增加的程度差异无显著意义，而KNRL细胞增加的程度有显著差异(p<0.05 )。

KNRL细胞裸鼠腹腔内注射实验显示，注射到裸鼠腹腔内的KNRL细胞发生胰腺、肝脏及胃浸润并形成肿瘤株，腹腔淋巴结发生转移。以上三项检测结果提示，KNRL细胞已发生了明显的恶性转化并且具有了浸润转移能力。

在临床手术过程中，剥离切除肿瘤和动脉血管的阻断易导致肿瘤病灶受挤压，碾挫，人为造成部分肿瘤细胞脱落，增加了肿瘤转移机会。在目前尚无完善的手段来改善肿瘤细胞间粘附能力的情况下，术前适当增加病人体内钙离子浓度，或术中在病灶内及病灶周围注入适量钙离子，或适当增加术野温度，如在胸腔或腹腔内加入41℃生理盐水等，或许对减少人为造成的肿瘤播散转移有帮助意义。

本研究利用分子生物学技术，探讨K-ras基因导入的鼠肺纤维细胞一恶性转化细胞的粘附结构、粘附分子和肌动蛋白的改变，旨在探讨肿瘤细胞的浸润转移机制。NRL细胞间，紧密连接、粘附连接和间隙连接等粘附结构完整存在。而KNRL细胞间，紧密连接和间隙连接完全消失。仅有少量、点状、类似粘附连接的结构存在，细胞间隙明显增宽。NRL细胞内，肌动蛋白呈丝状，平行、均匀分布。而KNRL细胞内，肌动蛋白丝轮廓不清楚，变成片块状，主要分布在细胞边缘和细胞表面突起形成的微绒毛内。

现已知，原癌基因有百余种，癌基因在肿瘤发生及进展过程中起着决定性作用。但不同的癌基因其致癌机制有所不同，而且不同的肿瘤、同一肿瘤的不同阶段都有不同的癌基因发生作用。癌基因的这种特点使得我们利用肿瘤组织块来研究某一个具体的癌基因在肿瘤生物学行为，包括肿瘤细胞浸润转移机制中的作用变得非常困难。

而利用分子生物学技术，将正常细胞导入确定的癌基因，然后考察其生物学行为的方法，则解决了这方面的难题。本研究KNRL细胞所导入的ras基因是一种保守的癌基因，有三个亚群，分别为K-ras,H-ras和N-ras，在许多恶性肿瘤，尤其是间质细胞来源的肿瘤中，可检测到K-ras基因及其表达。

NR工细胞是一种间质细胞，因此，本实验利用K-ras基因的作用使其发生恶性转化，通过细胞恶性行为检测发现，KNRL细胞倍增时间明显缩短，增殖能力明显增强，在裸鼠内呈浸润性增长和转移。提示K-ras基因在KNRL细胞内发生了表达，且是KNRL细胞具有肿瘤细胞生物学行为的直接原因。恶性转化细胞是肿瘤细胞的早期阶段，其形态和功能的改变是其后期生物学行为的主要原因，因此考察KNRL细胞的粘附结构及粘附分子的改变对于探讨肿瘤细胞的浸润和转移机制具有重要意义。

本研究显示，NRL细胞，光镜下平行有序排列，有规律极性、细胞与细胞间紧密连接。电镜下细胞紧密连接，细胞间粘附结构正常存在，免疫荧光标记、聚丙酞胺凝胶电泳及Westen印迹均显示构成粘附连接的粘附分子正常表达，细胞聚集能力明显高于KNRL细胞。而KNRL细胞，光镜下细胞排列明显紊乱，失去极性，细胞间隙明显增宽，呈松散样排列。电镜下紧密连接、间隙连接完全消失，仅存有少量、点状类似粘附连接的结构存在。免疫荧光标记、聚丙酞胺凝胶电泳及Westen印迹显示，钙粘素，a-链蛋白和p-链蛋白三种分子表达明显异常，甚至表达消失。

细胞聚集能力明显下降。提示在K-ras基因作用下，KNRL细胞的粘附结构和粘附分子表达受到损害。即K-ras基因的表达干扰了细胞粘附分子的形成和钙粘素的同源亲和性，前者使细胞间不能形成正常的粘附结构，而使得细胞间松散连接，易于分离，后者同样使得同型细胞间不能形成完整连接，而且可能与异型细胞间发生不正常的粘附，这可能是肿瘤细胞易脱离原发灶，与周围组织发生浸润和入血或淋巴液在转移器官重新浸润增长的一个主要原因。

a-链蛋白和p-链蛋白表达异常及由胞浆内转入到细胞核内，影响了细胞间信号传导的正常进行，使得细胞间分化、增殖信号传导处于不正常状态，也可能是肿瘤细胞无限制生长、浸润转移的原因。一些病理学文献报道许多恶性肿瘤的钙粘素，一链蛋白和p-链蛋白表达消失或下降，且下降程度与肿瘤的浸润转移能力正向相关，本研究结果支持上述观点。

间隙连接是另一种细胞间粘附结构，与其它粘附结构相比，除了有维持细胞间粘附能力外，两个相邻细胞还通过此结构进行细胞生长分化的信号传导，虽然组成该结构的分子到目前为止尚不十分清楚，但体外细胞培养实验显示，在器官形成过程中，正常情况下，当器官完全分化形成后，细胞增殖完全停止。当阻断间隙连接后，细胞增殖变得不受限制。因而提示，间隙连接同时也是细胞分化增殖的一个调节结构。

KNRL细胞间的间隙连接结构完全消失，提示K-ras基因的作用影响了间隙连接的形成，从而阻断了细胞间的增殖信号传导，使细胞处于增殖无序状态。推断间隙连接的损害在肿瘤细胞浸润转移中同样扮演重要角色。钙粘素属于钙离子依赖性细胞粘附分子，由其调节的细胞间粘附需要有钙离子的参与。有些学者认为，肿瘤细胞表面某些区域内缺乏钙离子，同缺乏粘附分子一样影响细胞间的粘附。不同温度对细胞间粘附的影响到目前为止尚未见到确切的报道。

本研究显示，单个悬浮的两种细胞加入到含有钙离子的细胞培养液内，细胞聚集能力均明显增强，且尤以KNRL细胞增加的更明显，差异有显著意义(P<0.05)，推断在钙粘素分子及细胞间粘附结构受到损害的情况下，适当增加细胞周围钙离子浓度会增强钙离子依赖性粘附分子的活性，从而增强了细胞间的粘附能力。

低温下((40C)两种细胞的聚集能力无明显改变。但在高温下(410C)KNRL细胞的聚集能力明显增强，差异有显著意义(P<0.05)，其原因不十分清楚，推测可能是适当高温同样增强了细胞粘附分子的活性，确切的机理有待于进一步研究。肿瘤细胞的浸润和转移是影响肿瘤治疗效果的主要原因。许多肘瘤患者因其严重的浸润，而无法切除，或因远隔转移而失去手术机会或术后肿瘤再发。

对于肿瘤细胞的浸润转移机制，国内外学者进行了半个世纪系统深入的研究，现已基本达成一致观点的是肿瘤细胞的浸润转移过程是一个复杂的多步骤连续过程，包括肿瘤细胞脱离原发灶，侵入基底膜和血管或淋巴管，进入第二器官，再次浸润，增生形成转移灶。至于为什么肿瘤细胞相对正常细胞更易于分离、转移，则不十分清楚，1984年Yoshida首先利用免疫组织化学方法发现，在正常细胞间存在着由某种特殊的蛋白质分子构成的粘附结构，用抗这种分子的单克隆抗体处理的细胞，这些细胞变得易于分离，并容易发生浸润性生长。

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