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文字：劲哥

引言

在本研究中，我们对NINJ1蛋白进行了深入的研究，并利用细胞和动物模型系统验证了其在质膜破裂中的作用。

我们发现，NINJ1蛋白的聚合形成的纤维束能够与质膜相互作用，并引发质膜的破裂，进而导致细胞的死亡。

我们还进一步研究了NINJ1与其他细胞死亡调控蛋白之间的相互作用和信号传导机制，揭示了NINJ1在细胞死亡过程中的重要调控网络。

本研究的结果对于理解细胞死亡的调控机制具有重要意义，并为开发针对溶解性细胞死亡的新型治疗策略提供了潜在的靶点。

通过深入研究NINJ1在细胞死亡中的功能和作用机制，我们有望为疾病治疗和组织修复等领域提供新的治疗策略和方法。

随着我们对NINJ1蛋白功能的进一步了解，我们相信将能够揭示更多关于细胞死亡的奥秘，并为相关疾病的预防和治疗带来新的突破。

一、实验目的

NINJ1是一种16 kDa的质膜蛋白，具有进化保守性，在所有高等真核生物中都有发现。预测其含有两个穿膜螺旋，其末端位于细胞外空间。

在炎症小体驱动的火焰细胞死亡中，NINJ1在细胞死亡执行因子gasdermin D（GSDMD）被激活后诱导质膜破裂（PMR），而GSDMD又通过半胱氨酸依赖的剪切被激活,PMR与NINJ1高级聚合物和膜突起的形成同时发生。

为了更好地理解这些事件之间的关系，并研究NINJ1聚合物在炎症小体激活后的组装动力学，我们在小鼠骨髓源巨噬细胞（BMDM）中进行了交联实验。

与NINJ1的逐渐聚合一致，我们在炎症小体激活后10分钟检测到NINJ1二聚体和三聚体的形成；随后在较晚的时间点，NINJ1发生广泛聚合形成更大的聚合物.

大部分NINJ1的聚合与剪切的GSDMD p30完全寡聚化，即GSDMD孔的形成是一致的，表明NINJ1激活发生在GSDMD激活之后。通过释放过大无法直接通过GSDMD孔释放的乳酸脱氢酶（LDH）来量化PMR11,12,13。

值得注意的是，在炎症小体激活后，释放的LDH量随时间缓慢增加，而NINJ1的聚合已在LDH释放开始时可检测到，后续时间点只略微增加。

小量NINJ1二聚体也可在活细胞中检测到，这表明高级NINJ1聚合物是活性物种。因此，这些时间分辨数据完全支持NINJ1聚合对PMR的必要性。

图1显示了质膜NINJ1的聚合动力学。

图中的a、b：

通过蛋白质印迹分析检测了经过尼日利西林刺激（Nig）的预处理BMDM中内源性GSDMD和NINJ1的情况。a图显示了经过1.5小时尼日利西林刺激后的结果，b图显示了经过2、5、15、25、55或85分钟尼日利西林刺激后的结果，随后用不可渗透的BS3交联剂处理5分钟。FL代表全长。值得注意的是，在尼日利西林处理条件下，BS3通过GSDMD孔进入，导致微管蛋白发生交联，因此在这里微管蛋白用作加载控制。b图中的时间表示尼日利西林和BS3处理的总孵育时间。

图中的c：

在尼日利西林刺激后，通过测量预处理BMDM释放的乳酸脱氢酶（LDH）来评估质膜破裂。

图中的d：使用时序荧光共聚焦显微镜观察共表达hNINJ1-GFP和opto-casp1的HeLa细胞光激活后的情况。图像显示细胞基面上NINJ1-GFP荧光和DRAQ7渗入（从z堆叠的最大投影），以跟踪质膜渗透性。时间经过标准化，以DRAQ7核荧光增加的开始为基准。白色箭头表示放大的区域。比例尺为10 µm。

图中的e-g：

归一化量化显示了细胞基面上NINJ1-GFP（e）、HA TMD-GFP（f）或E-cadherin-GFP（g）的分布不均匀性，以及opto-casp1光激活后DRAQ7核荧光强度。每个时间点的分布不均匀性（Dt）相对于实验开始时的分布不均匀性（Di）进行归一化。

这些数据是通过多个实验的平均值±标准差得出的，其中b图为2个独立实验，a图为3个独立实验，d图为14个独立实验，c图为三个样本的汇总结果，e-g图至少为10个独立实验。

二、实验过程

2.1NINJ1形成聚合物纤维

接下来，我们使用随机光学重建显微镜（STORM）研究了火凤凰细胞中NINJ1组装物的纳米尺度组织结构。为此，我们使用了hNINJ1-GFP和DmrB-caspase-4的HeLa细胞。

DmrB是一个二聚模块，可以通过外源的、可渗透细胞的配体激活caspase-4（人类caspase-11同源物），并进而激活GSDMD16,17。我们使用抗GFP纳米抗体和广域荧光显微成像来特异性标记和成像hNINJ1-GFP结构。

对于STORM，我们使用单分子定位分析的全内反射荧光（TIRF）照明来超分辨率成像质膜中的NINJ1组装物。

活细胞显示出小型NINJ1点的均匀分布，这些点可能是单个分子或小的聚合物，以及一些小且大多呈圆形的聚类体。

相比之下，正在发生扩散的火凤凰细胞显示出较大的NINJ1聚类体，其尺寸从约500 nm到几微米不等。

这些聚类体的形态高度分支，个别分支向不同方向突出，有点类似于纤维状ASC颗粒的组织结构。这些聚类体对应于广域荧光和共聚焦显微镜观察到的大点。

再次强调，火凤凰在过程中并未观察到控制蛋白HATMD的聚类体形成。为了量化细胞死亡激活后NINJ1纳米尺度组织结构的变化，我们进行了基于密度的聚类分析，确定了每个区域的聚类体数量、聚类体大小和形状，以及每个NINJ1聚类体中的单分子定位数目。

这项分析显示，在caspase激活后，每个细胞表面积中识别到更多的聚类体，并且这些聚类体比非激活的细胞显著更大且更不球形。

在约10%的细胞中，我们还观察到长达几微米的NINJ1纤维，连接着更大的组装体。

总之，超分辨率显微镜分析显示，在火凤凰细胞中，NINJ1形成具有分支纤维形态的大聚类体，以及微米级别的长纤维。

2.2NINJ1纤维的原子结构

为了在原子水平上表征聚合态的NINJ1，我们在大肠杆菌中重组表达了全长野生型hNINJ1，并使用非洗脱β-D-麦芽糖苷酯（DDM）洗脱从细菌膜中提取。

通过负染和冷冻电镜（cryo-EM），我们观察到纯化的蛋白质呈长丝状，具有不同程度的弯曲，偶尔闭合形成环状结构。

纯化的hNINJ1丝状物质的质量定量表明平均分子质量约为1.3 MDa。hNINJ1丝状物质的结构由cryo-EM确定。通过一次谱分析和后续的螺旋精炼，利用代表顶视图的清晰2D类和初始3D体积确定了螺旋参数，最终得到了cryo-EM图。

这些纤维是亚单位的线性堆叠，亚单位之间间隔为20.95 Å，每个亚单位有轻微的-1.05°旋转。cryo-EM图的分辨率为3.8 Å，使我们能够建立hNINJ1纤维的分子模型。

hNINJ1的前38个残基保持无序状态，如溶液NMR弛豫实验所示，这与AlphaFold的预测和先前的NMR实验结果19,20完全一致。实际上，截短实验表明这些残基对于hNINJ1纤维形成是可有可无的。

接下来的103个残基（39-141号残基）在地图中有很好的表示，并且可以明确地建模为四个α螺旋α1-α4。值得注意的是，实验密度包括两个相同的hNINJ1纤维，它们以反向平行排列。

三、实验结果

在分析NINJ1纤维的表面疏水性时，我们观察到纤维的一面是亲水性的，而另一面是疏水性的。

这些特性直接解释了为什么两个hNINJ1纤维通过它们的疏水性面层叠在一起，形成了cryo-EM分辨的可溶双纤维。

具有一个疏水性面和一个亲水性面的纤维拓扑结构是形成孔形成蛋白质的典型特征，例如gasdermins、穿孔素或细菌毒素，因此很容易与细胞中的功能角色相联系，这些纤维可能覆盖在膜边缘上，使脂双层膜发生破裂。

与这一观点一致，曲线状的疏水性界面的高度约为26 Å，与真核生物质膜的平均厚度相匹配25。我们测试了NINJ1增加脂质体膜通透性的能力。

我们将NINJ1重构到包含1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）和1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油酯）（POPG）脂质以及微量荧光脂质硝基苯并噻二唑磷酸胆碱（NBD-PC）的蛋白质脂质体中。

加入膜不透性分子二硫代硫酸盐会熄灭NBD-PC的荧光，只作用于暴露于大量溶液的两侧脂质层。与NINJ1诱导膜破裂的假设一致，NINJ1蛋白质脂质体的相对渗透性随膜中hNINJ1的蛋白质：脂质比例增加而增加。

接下来，我们使用分子动力学模拟来探索体外超结构hNINJ1在膜边缘的稳定性。两个位于膜片相对边缘的线性纤维在粗粒度模拟中保持紧凑和稳定，持续至少20微秒，在全原子模拟中持续至少1微秒-每个情况均得到两个独立重复实验证实，并在包含实验双纤维的控制模拟中得到确认。

接下来，我们在体外模拟中通过将45聚合物纤维重新排列成一个环，创建了一个小的NINJ1孔。在150微秒的粗粒度模拟中，NINJ1聚合物保持结构稳定，尽管相邻亚单位之间的相对取向存在一定的变化。

相比之下，缺乏α1和α2螺旋的NINJ1环的类似模拟经历了结构塌陷和环聚合物的闭合。

在几微秒内，相邻亚单位的α3和α4螺旋之间形成相互作用，并在几十微秒内在整个聚合物中传播，几乎完全闭合了环。

由于在类似的模拟条件和持续时间下，结构缺陷的gasdermin A3孔经历了显著的重塑26,27，稳定的NINJ1孔的观察和缺乏螺旋α1和α2的截断变体的闭合强烈暗示NINJ1纤维能够以不同的排列形式覆盖膜边缘。

因此，α1螺旋既稳定NINJ1纤维又赋予局部可塑性，在穿孔密集包装的细胞膜中可能是至关重要的。

四、结论

总结起来，活性的NINJ1具有独特的结构，具有长的α-螺旋纤维，覆盖在膜边缘。

与GSDMD孔道的β-折叠结构具有有限的孔径，可以释放白细胞介素，同时保留较大分子13不同，NINJ1纤维引起的膜孔或损伤在实质上没有尺寸限制。

NINJ1损伤在功能上与激活的线粒体Bax和Bak的大型超结构相关，因为它们都溶解膜。虽然目前尚无Bax或Bak以形成孔道的构象的原子结构可用，但我们推测NINJ1纤维中α3和α4的螺旋髮夹可能在功能和结构上与激活的Bax中的α5和α6的螺旋髮夹显示相似之处。

NINJ1最初被报告为一种黏附分子，在坐骨神经损伤后诱导并促进轴突生长。考虑到NINJ1引起细胞死亡和DAMP释放，以及细胞死亡、炎症和组织修复之间存在密切联系，可以想象NINJ1通过引起炎症或释放刺激分子而在促进轴突生长方面起到间接作用。

相反，NINJ1也可能具有双重作用，在细胞-细胞黏附和作为强渗透压下膜的断裂点两方面发挥作用。这种结构以及突变研究为什么NINJ2不能在功能上取代NINJ1提供了可能的解释，尽管两种蛋白在结构化部分有少量氨基酸差异，并且在非结构化N端存在大片缺失和多个突变。

在结构化区域的差异之一是残基47，NINJ1中是丙氨酸，在NINJ2中是缬氨酸。A47L突变使NINJ1在HEK细胞中功能失调，为NINJ2的功能失调提供了可能的解释，很可能其他差异也导致了功能的进一步扰动。

值得注意的是，NINJ1代表了在火凤凰途径中出现的另一个纤维形成事件，与ASC、NLRP3和caspase-1的可溶性纤维PYD和CARD域纤维一起，NINJ1纤维代表了细胞解体的一个精巧的生物物理机制，对其原子结构的了解为治疗癌症、感染和炎症性疾病开辟了机会。

参考文献：

《细胞死亡差异》2018年第25期的文章《细胞死亡的分子机制：细胞死亡命名委员会的建议》由Galluzzi撰写。

《澳大利亚实验生物学和医学科学杂志》1977年第55期的文章《特异性过敏淋巴细胞附着后细胞通过凋亡死亡的研究》由Don等人撰写。

《自然》杂志2021年第591期的文章《NINJ1介导细胞溶解性死亡过程中的质膜破裂》由Kayagaki等人撰写。