文 | 渔言农说

全球每年消耗大量的化石能源和化学品。此外，石油的大量燃烧也增加了二氧化碳的排放，导致温室效应和随后的全球变暖。

从热力学的角度来看，高温乙醇发酵提供了几个优点，例如降低了有害微生物污染的风险，降低了生物反应器的冷却成本，提高了乙醇生产率。

由于它们对高浓度乙醇和发酵过程中形成的有毒物质的耐受性，酵母已被证明比细菌更适用于乙醇生产。

为了克服目前工业发酵的限制和挑战，人们不断探索新的耐热、产乙醇的酵母，这些酵母能够在高温下生长和生产乙醇。

酵母菌种类广泛分布在自然界中，具有不同的生态系统，许多研究人员一直试图分离这些来自不同生态位物种，如甘蔗、木薯和菠萝种植园的土壤，腐烂的水果或自然发酵的来源。

材料与方法

1.样品采集和分离

甘蔗田土壤样本采集自泰国Uttaradit (UD)、Kamphaeng Phet (KP)、Chai Nat (CN)、素可泰(ST)、Nakhon Sawan (NS)和Phitsanulok (PHS)等。

采用酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)肉汤(1%酵母浸膏，2%蛋白胨和2%葡萄糖)添加4%(体积/体积，v/v)乙醇，0.025%丙酸钠(P1880，σ，Oakville， Canada)和0.02%氯霉素。

取2克土壤样品加入50ml含有抗生素和4% (v/v)乙醇浓度的YPD肉汤中，室温孵育24小时。然后，将富集培养物在YPD琼脂板上划线，并在37℃孵育，直到出现单个菌落。收集所有纯培养物，并在4℃的YPD琼脂上进行短期保存。

为了长期保存，将每个分离菌的单个菌落悬浮在添加25%甘油的YPD肉汤中，并保持在80℃。

参考菌株为酿酒链球菌TISTR 5606(一种工业乙醇生产菌株)，购自泰国曼谷的泰国科学技术研究所。

2.酵母耐热性和乙醇耐受性的检验

分离酵母在30℃的YPD培养液中预培养，然后接种到新鲜的YPD培养液中，直到生长达到早期稳定期(约9-12小时)。

对每种酵母菌分离物在高温(45℃)下的生长性能进行了测试，在YPD琼脂中分别添加7%、10%、13%和15% (v/v)的乙醇，以测定不同乙醇添加水平下的生长能力。在37℃和45℃的温度下监测酵母的生长，每个实验重复两次。

3.耐热酵母高温发酵活性试验

首先，在YPD肉汤中测试分离酵母在37℃、40℃、42℃和45 ℃条件下生产乙醇的能力。

筛选乙醇发酵使用Durham发酵管，将0.1mL活性细胞接种到YPD肉液(9 mL)中，在含有Durham管的试管(直径18 mm，150 mm)中，然后在不同温度下静态孵育。

每6小时监测达勒姆管中二氧化碳气体的积累情况。在达勒姆管中含有气体的分离物被选择作进一步分析。

为了确定酵母菌分离株的糖利用能力，简单地说，本研究制备了含有2% (w/v)葡萄糖、蔗糖或木糖作为碳源的YP肉汤。

每个酵母菌分离物使用杜伦管在含有不同碳源的YP肉汤上培养。

然后，所有被测试的培养保持在37℃。记录了Durham管的天然气产量，所有的实验都做了三遍。

4.乙醇产量估算

为了使用气相色谱分析定量估计乙醇产量，酵母细胞在30℃的YPD肉汁中有氧预培养到指数期。

然后接种于250mL的Erlenmeyer烧瓶中，其中含有100mL新鲜培养基的YPD肉汤，其中含有16% (w/v)葡萄糖作为碳源。

进一步培养前细胞的初始光密度值为0.1，在135 rpm的摇箱中在特定温度(40℃和45℃下孵育)。

在孵育24小时、36小时和48小时后，从每个瓶中取出一部分发酵液，在4 ℃下，在16，200✕g下离心10分钟。

收集上清并进行气相色谱，以测量乙醇的浓度，采用R程序进行单因素方差分析和Duncan's多极差检验，检验分离物与参考分离物的乙醇产量是否有显著差异(p < 0.05)。

5.分离酵母的鉴定

采用醋酸锂DNA提取法从酵母细胞中提取基因组DNA。

所有扩增产物均使用FastGene™凝胶/PCR提取试剂盒，使用ABI Big Dye终结者3.1版循环测序试剂盒和自动Prism 3730XL DNA分析仪。

测序后，获得的核苷酸使用BLAST程序从其他酵母物种中寻找同源序列。随后，使用CLUSTALW软件比对从本研究中获得的新分离株的D1/D2 LSU rDNA序列和从数据库中检索到的其他耐热酵母的D1/D2 LSU rDNA序列，并在UGENE软件中实现。

采用邻域连接(NJ)和最大似然(ML)方法构建系统发育树。使用GTR + G + I模型和PhyML 3.0软件进行ML树，并使用100次bootstrap复制验证每个拓扑。

NJ树是根据MEGA7软件中使用p距离法计算的进化距离数据生成的，该进化距离数据实现了1000次自举复制。

本研究将NUNSe4、NUNSe5和NUNSe6分离株的D1/D2 LSU序列分别作为LC371651、LC371652和LC371653保存在GeneBank中。

结果

1.耐热-乙醇耐酵母菌的筛选

利用富集培养的YPD肉汤，并在37℃的YPD琼脂上生长，总共获得了60株酵母菌分离株。

其中，30株分离株可在45℃下生长，然而，这30株分离株中有6株(NUCNe1、NUCNe2、NUCNe3、NUCNe4、NUCNe5和NUCNe6)对45℃的耐受性低于其他分离株。

这30个分离株被归类为耐热酵母，因为它们能够在高于40 C的温度下生长。

此外，所有30株菌株都能在含有7% (v/v)乙醇的YPD琼脂上生长。有趣的是，三个分离株(NUNSe4， NUNSe5和NUNSe60)在含有13% (v/v)乙醇的YPD琼脂中生长。然而，30个分离株在乙醇浓度为15%。

2.耐热发酵酵母的筛选

考虑到不同菌株在高温下的发酵能力，从之前的实验中选择了30株菌株，通过在Durham试管中监测其产气量来初步确定。

结果表明，以葡萄糖为碳源，在37℃、40℃和42℃条件下培养36小时，30株酵母菌均具有产CO2的发酵活性。

有趣的是，只有NUNSe4、NUNSe5和NUNSe6菌株在45 ℃时产气。此外，所有30株酵母菌都在含有不同碳源(蔗糖和木糖)的YP肉汤上生长，并在37℃下孵育。

结果表明，NUUD、NUKP、NUCN、NUST和NUPHS菌株均能以蔗糖为碳源，但不能以木糖为碳源。然而，NUNSe4、NUNSe5和NUNSe6既不能利用蔗糖，也不能利用木糖。

3.气相色谱法在不同温度下生产乙醇

本研究采用含16%葡萄糖的YPD培养液在40℃和45℃条件下对NUNSe4、NUNSe5、NUNSe6和酿酒酵母TISTR 5606的乙醇产量进行了研究。

在40℃条件下发酵24小时后，NUNSe4(58.78±0.51 g/L)、NUNSe5(49.39±1.04 g/L)和NUNSe6(53.16±0.59 g/L)的乙醇产量显著高于TISTR 5606(34.37±0.74 g/L)。

在40℃条件下，NUNSe4(88.60±0.75 g/L)、NUNSe5(78.52±0.21 g/L)、NUNSe6(77.97±0.65 g/L)和TISTR 5606(65.37±0.82 g/L)培养48小时后，乙醇浓度最高。

在45℃下培养时，分离菌株NUNSe4、NUNSe5和NUNSe6与参考菌株相比仍保持较高的乙醇产率水平(p < 0.05)。

分离菌株NUNSe4(54.30±0.97 g/L)、NUNSe5(37.73±1.46 g/L)和NUNSe6(44.04±0.92 g/L)在45℃时乙醇产量最高。参比物在45℃条件下孵育36小时后，乙醇的最高浓度为4.067±0.38 g/L。

4.耐热酵母菌的鉴定

BLAST结果显示，本研究获得的D1/D2 LSU rDNA序列与P. kudriavzevii (CBS 12548)型的D1/D2 LSU rDNA序列完全相同(100%同源性，e值为¼0.00，525个核苷酸覆盖率)。

根据大亚基rDNA的D1/D2结构域序列，ML和NJ的系统发育树具有相同的拓扑结构，因此在图3中只给出了ML树。

结果表明，3株分离株NUNSe4、NUNSe5和NUNSe6与P. kudriavzevii型菌株(NRRL Ye5396)在P. kudriavzevii分支中归为一类，ML(100)和NJ(100)方法均具有较强的支持值。

因此，分离菌株泰国NUNSe4、NUNSe5和NUNSe6被鉴定为P. kudriavzevii。

作者观点

高温乙醇发酵过程成功的最重要关键是利用强效耐热酵母，这可能克服许多障碍。因此，嗜热或耐热微生物或两者兼而有之，对工业应用具有极大的兴趣。

本研究试图从泰国的天然来源中发现新鉴定的耐热酵母菌分离株，高温和乙醇暴露是酵母细胞的致死压力。

酵母细胞在温度高于35℃或乙醇浓度高于4e6% (v/v)后合成热休克蛋白是强诱导的响应特性。

利用温度和乙醇浓度的选择压力分离出几种耐热酵母。据报道，高温和乙醇浓度大于3%的影响直接影响微生物的生长。

因此，在乙醇浓度为4% (v/ v)和35℃孵育条件下作为本研究中分离耐热酵母的选择压力。

在筛选耐热性方面获得的结果与先前的研究一致，这些研究报道了耐热酵母，包括S1-2， S6-1， S10-2， KKU-TH33， KKU-TH43， KKU-VN8， KKU-VN20和KKU-VN27，也可以在高达45℃的温度范围内生长。

然而，酵母在这些高温下的生长能力取决于不同的酵母菌株和个体的特定生长速率。

在发酵过程中，酵母细胞必须遇到各种压力，如热量和乙醇浓度。细胞机制涉及保护酵母细胞免受各种物理和化学压力的影响。

乙醇浓度高于10% (v/v)会对酵母细胞代谢和生长产生负面影响，并可能破坏细胞壁，降低特定生长速率，增加细胞死亡或改变质膜和运输系统的通透性。

因此，能够耐受乙醇浓度高于10% (v/v)的酵母细胞对于乙醇工业的使用是必要的。乙醇或胁迫耐受性的差异可能是由于分离酵母菌株的天然来源和类型的差异。

耐热酵母菌P. kudriavzevii RZ8e1可以在含有12% (v/v)乙醇的酵母提取物和麦芽提取物(YM)琼脂中生长，温度为35℃。

Abe等(2009)报道酿酒酵母野生型W303e1A在含有1%酵母膏、2%蛋白胨、0.02%硫酸腺嘌呤和2%葡萄糖(含8% (v/v)乙醇)的酵母膏蛋白胨-硫酸腺嘌呤葡萄糖(YPAD)琼脂上有轻微生长，但在含有10%或13% (v/v)乙醇的琼脂上不能在30℃下生长。

参考文献

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