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引言

许多古细菌谱系栖息在海洋表层沉积物中，尽管它们的分布、代谢能力和种间相互作用在科学研究领域仍然处于相对空白的状态。

我们从CR边缘恢复了古细菌的宏基因组组装基因组(MAGs)，并将它们与来自较浅环境的近亲进行了比较。

本次实验研究了6个不同古细菌谱系(Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea)的31个mag，并对Lokiarchaeota和Bathyarchaeota门的代表性mag进行了全面分析。

我们将基因组学和热力学模型结合起来，强调了不同古细菌谱系之间共生相互作用的生态和生理条件，并利用系统发育推断来解释CR深层沉积物中深海古生菌非典型共生作用的发展。

如果Lokiarchaeota与使用硝酸盐、亚硝酸盐和亚硫酸盐作为电子受体的生物体结合，那么Lokiarchaeota降解苯甲酸盐在遗传上是可能的。

这些代谢特征表明，这个深海古菌谱系可能是产甲烷和产丙酮的深海古菌谱系之间的过渡。

一、深海沉积物中的古细菌分布、生态作用和适应策略研究进展

海洋地下沉积物富含不同的古细菌谱系，尽管它们的分布、生态作用和适应策略尚未得到充分研究。

宏基因组测序和单细胞基因组学使新生物体的发现、新代谢的阐明、已知谱系的扩展和基因树部分的重新定义成为可能。

深海海底分解的基因组仍然很少，这意味着深海生物圈中特定生态位的适应尚未得到很好的理解。

阿斯加德古菌的基因组分析表明，其真核同源物丰度很高，并表明其代谢功能多种多样。

从主要依赖于通过Wood-Ljungdahl途径和丙酮生成的碳固定的自养生活方式，到使用甲基com还原酶样酶消耗蛋白质和脂肪烃的异有机营养生活方式。

深海archaeota是另一种古细菌门的成员，其特点是具有广泛的代谢范围，能够异养清除蛋白质、碳水化合物、短链脂质和其他作为底物的还原化合物，以及它们的甲烷代谢潜力。

深海古生物基因组也表明了碳固定和丙酮生成的潜力，深海archaeota的甲烷生成和丙酮生成途径的进化路径仍未得到解决。

我们详细研究了从CR边缘的宏基因组中恢复的古细菌基因组，并将它们与从较浅地点恢复的近亲进行了比较。

本次实验研究了31个古细菌宏基因组组装基因组(MAGs)，它们属于6个不同的古细菌谱系(Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea)。

我们对Lokiarchaeota和Bathyarchaeota两个新的古细菌谱系进行了代表性的MAGs分析，分析表明，Lokiarchaeota基因组编码厌氧处理和降解脂肪烃和芳烃的基因。

二、DNA提取和测序以及宏基因组组装的基因组分类

使用IQ-Tree基于16种核糖体蛋白(L2、L3、L4、L5、L6、L14、L15、L16、L18、L22、L24、S3、S8、S10、S17和S19)的串联计算出最大基因树。

基于最佳拟合替代模型(VT + F + R10) 计算进化距离，并使用1000个超快速自举和近似贝叶斯计算对单个分支位置进行测试。

使用HMMsearch工具对代表特定代谢途径关键基因的定制HMM数据库筛选来自所有MAGs的预测蛋白。

通过使用BlastKoal在KEGG数据库中查询预测蛋白来评估通路的完成度，鉴定碳水化合物活性酶，进行细胞定位鉴定。

使用USEARCH-ublast对MEROPS数据库进行蛋白酶、肽酶和肽酶抑制剂的鉴定，转运蛋白鉴定，检测每个bin中预测蛋白的系统发育分布。

使用相应的KEGG条目作为搜索关键字，手动整理对齐的序列,计算系统发育树，并使用最优拟合模型描述进化关系。

对CR Lokiarchaeota及其潜在伙伴中提出的氧化还原反应进行初始吉布斯自由能(ΔrG’)计算，使用平衡器，应用pH为8，每种反应物浓度为1mm。

通过计算CR位点U1378和U1379近原位条件下五个氧化还原反应的吉布斯自由能，进一步证实了为新的CR Lokiarchaeota基因组提出的耦合氧化还原反应是否可行。

吉布斯自由能的计算公式为:

在这项研究中，ΔG0r使用每种物质的标准吉布斯生成自由能热力学数据计算，并使用R包CHNOSZ修正为接近原位压力和温度(4°C)。

Qr为反应商，可通过关系式计算

三、基于16S rRNA基因分析的优势古细菌谱系多样性

在CR边缘的5个深度的沉积物样本中，古细菌的丰度很高。

从这些样本中收集宏基因组数据并检查小亚基核糖体基因,从宏基因组中共恢复了126条16S rRNA基因序列。

与古细菌相关的序列(31个序列占总数的25%)代表了广泛的谱系多样性，包括深海archaeota、热原体和Lokiarchaeota。

在分析的5个深度中，回收了31种不同的古菌mag草图，仅对11种完整性高、污染低(完整性高于60%、污染低于5%)的mag进行了基因组分析。

通过将他们预测的蛋白质与NCBI (nr)数据库进行比较，进一步评估基因组质量，以评估分类基因组内系统发育一致性的程度。

每个MAG中大多数预测蛋白的分类归属(60-75%)与各自的系统发育类群一致，但CR_12中只有15%的编码蛋白属于Heimdallarchaeota，被排除在进一步的分析之外。

使用16种核糖体蛋白确定草图基因组的系统发育位置，实验发现的MAGs隶属于6个不同的系统发育谱系，即Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea。

所有从CR沉积物中回收的古细菌MAGs都含有真核特征蛋白(ESPs)，这些esp包括专门用于信息处理、运输机制、泛素系统、细胞分裂和细胞骨架形成的蛋白同源物。

从CR中恢复的阿斯加德古菌基因组，例如Heimdallarchaeota和Lokiarchaeota MAGs (CR_06, CR_11)，显示出大量真核同源物，并覆盖了广泛的ESPs类别。

在CR中回收的深海archaeota, Hadesarchaeota和Thermoplasmata MAGs中也检测到esp，只有阿斯加德基因组具有细胞分裂和细胞骨架的同源物。

MCR复合物基因(mcrABCDG)在微基因组和整个宏基因组中均不存在，说明CR沉积物中的短链烷烃未被MCR复合物氧化。

使用定制的HMM搜索，筛选所有宏基因组读数和mag，以寻找可能的替代碳氢化合物降解途径，这些搜索专门针对脂肪族和芳香族碳氢化合物降解途径的关键代谢基因。

成功发现了多种途径，包括甘酰基自由基酶相关基因与正烷琥珀酸合成酶(AssA)和苄基琥珀酸合成酶(BssA)偶联，通过在正烷和单芳香族化合物与富马酸盐之间形成C-C键形成碳氢化合物加合物，分别激活正烷和单芳香族化合物。

由于Lokiarchaeota CR_06的污染水平最低，从Lokiarchaeota CR_06中恢复的BCR亚基B的系统发育分析表明，它们隶属于Bzd纲，由4个亚基(BzdONPQ)组成。

这种BCR类型最初是在β变形杆菌属、偶氮古菌属埃万西i中发现的，在CR_06中检测到的BCR与在不同的β、δ变形杆菌属和其他古细菌谱系(如Lokiarchaeota、Bathyarchaeota和Archaeoglobus)中检测到的BCR密切相关。

亚基P和Q具有ATP结合/ATP酶功能域，并通过[4Fe-4S]簇连接在一起。

还原后的铁还毒素将电子转移到辅酶a酯结合域(O和N亚基)，催化苯甲酰辅酶a芳环的裂解，生成二烯基辅酶a产物。

在CR_06中，BCR复合体的4个亚基位于一个连续的操纵子(CR_06-contig-100_3495)上，但由于基因组的高度碎片化，没有在相邻的基因组邻域中发现可靠的系统发育标记基因。

对于CR_06 MAG的高片段化水平(支架数= 1110)，尽管基因组表现出> 200x的高覆盖水平，一个合理的解释是，存在高水平的系内菌株异质性。

CR_ Lokiarchaeota (CR_06)和其他位于CR边缘的Asgard古菌可能以芳烃为食异养生长

Asgard MAGs基因组内容中编码不同类型细胞色素氧化酶和厌氧呼吸的基因的缺失(CR_06, 07, 08, 11和12)表明它们无法将这些碳氢化合物完全矿化为CO2和H2O，这将允许高能量产量。

它们为介导这些有机大分子发酵成醋酸酯和其他还原产物的基因编码，在正ΔrG '值(ΔrG ' = 196.3 [kJ/mol])的CR条件下，这在热力学上是不利的，因为这意味着这些基因是选择性维持的。

由于基因组不完整(86%完整)，我们不能排除存在完整的芳香烃矿化途径的可能性，使用一种或多种氧化底物作为电子吸收。

更有可能的情况是，Lokiarchaetoa通过与能够氧化生物降解中间体的伙伴的共生相互作用获得能量。

通过比较所有可能的代谢和热力学情景来推断海洋地下条件下潜在的共生伙伴的身份，并根据宏基因组数据集中代谢途径的存在和每种条件下的热力学可行性来衡量每种情景。

我们计算了各种底物浓度条件下偶联反应的吉布斯自由能，最佳条件表明，苯甲酸酯(芳香烃降解途径中的中心代谢中间体)的降解可能发生在以下代谢条件下:

(a)苯甲酸酯矿化为CO2和H2O，亚硝酸盐还原为氨(ΔrG ' =−1206.3 [kJ/mol]);

(b)苯甲酸盐矿化生成CO2和H2O，亚硫酸盐还原生成硫化氢(ΔrG ' =−373.6 [kJ/mol]);

(c)苯甲酸酯矿化为CO2和H2O，硝酸盐还原为亚硝酸盐(ΔrG ' = - 119.9 [kJ/mol])。

交换底物的类型和复杂性是影响Lokiarchaeota同养关系和同养伙伴身份的另一个关键因素。

编码膜结合电子分叉类[NiFe]氢化酶的基因3b和3d组的存在，它们将NADH+和NADPH+的氧化与H2的进化结合在一起，也表明Asgard和它们的伙伴之间存在氢的协同交换。

在共生伙伴之间有效的底物和电子交换需要生物导管(如IV型毛或鞭毛)或某种允许细胞外电子转移的电子穿梭体(如多血红素细胞色素)的存在，我们筛选了CR_06的这些机制，并确定了种间底物和电子交换的两个候选机制。

代谢分析表明，CR_14含有编码不完全甲基营养产甲烷途径的基因，但缺少编码MCR复合物(mcrABCDG)的关键基因。

CR_14显示出利用第4组氢化酶(甲酸氢解酶)将甲酸作为电子和氢供体的潜在能力，这些电子通过三甲胺氧化物还原酶或厌氧二甲基亚砜还原酶(TMAO/DMSO还原酶)将三甲胺n -氧化物(TMAO)还原为三甲胺。

编码三甲胺特异性corcoroid蛋白的基因以及多种甲基转移酶CoB - CoM异二硫还原酶/F420非还原性氢化酶(hdrABCD和mvhADG)的存在表明，CR_14有能力回收辅酶M (CoM)和辅酶B (CoB)，并将甲基从三甲胺转移到CoM- sh。

我们找到了编码四氢甲烷蝶呤s -甲基转移酶(mtrA- h)的基因，表明mtrA蛋白将甲基从CoM转移到5,6,7,8-四氢甲烷蝶呤(H4MPT)，并通过CODH/ACS复合物的β亚基将甲基吸收成乙酰辅酶a，取代了Wood-Ljungdahl途径甲基分支的功能。

CR_14是唯一具有从单甲基化、二甲基化、三甲基化化合物中转移甲基的深海古菌MAG。

深海archaeota CR_14的这些集体代谢特征表明，该基因组可能代表了一个谱系，通过采用非典型的产甲烷生活方式，在产甲烷和产醋酸的深海archaeota之间建立了桥梁。

乙酰辅酶a合成酶β亚基(AcsB)的系统发育树显示，CR_14 AcsB基因与从其他深海古菌系、Asgard门、Chloroflexi和Altiarchaeales中恢复的基因聚集在一起。

该分支的独特性源于先前的假设，即Altiarchaeales成员拥有一个古老版本的AcsB。

Chloroflexi的成员编码了这种古细菌版本的ACSβ亚基，类似于深海archaeota、Asgard门和Altiarchaeales中的ACSβ亚基。

这种ACS类型支持阿斯加德古菌依赖氢的自养生活方式，我们假设深海archaeota具有ACS类型，能够利用不同的载体蛋白(CoM, H4MPT，以及可能是其他未知的载体蛋白)将甲基结合到乙酰辅酶a中，使深海archaeota能够吸收来自各种甲基化化合物的甲基。

所有CR古菌MAGs都富含ESP编码基因，这些真核生物同源物的广泛分布表明，ESPs在厌氧古细菌中比以前认识到的更为普遍。

实验中使用的沉积物是从更深的深度收集的，因此分析重点是属于深海archaeota和Lokiarchaeota的mag，以了解它们在深海沉积物条件下的生态潜力。

深海沉积物富含脂肪族和芳烃，为相关微生物提供了相当一部分的能量和碳需求。

碳氢化合物的降解仅限于有限的细菌和古细菌门(如Aminicenantes, TA06, Aerophobetes, Atribacteria, Helarchaeota和Bathyarchaeota)。

考虑到在海底沉积物能量有限的条件下芳烃分解的高能量需求，当CR_Asgard/CR_Lokiarchaeota具有发酵和/或产丙酮的生活方式时，在它们的基因组中发现atp依赖的BCR复合物(Bzd类)令人感到意外。

Lokiarchaeota的潜在伙伴属于不同的代谢组(例如硝酸盐还原剂、亚硝酸盐还原剂、硫酸盐还原剂、亚硫酸盐还原剂和硫代硫酸盐还原剂)，但在地下条件下，只有亚硫酸盐、硝酸盐和亚硝酸盐还原剂在热力学上更受青睐。

总结

本次实验中，我们采用了基于宏基因组学的基因组学方法，从5个不同样品的宏基因组数据集中成功恢复了31个mag，分别属于古菌门(Lokiarchaeota, Thorarchaeota, Heimdallarchaeota, Bathyarcheota, Thermoplasmatales和Hadesarchaea)。

只有11个mag符合我们的完成和污染阈值(>60%完成和<10%污染)，并被纳入详细的基因组分析和代谢重建。

超过90%的高质量基因组隶属于深海archaeota和Asgard门，每个MAG中预测的蛋白质的系统发育关系证实了本研究中考虑的MAG的适当质量。

在相同的环境条件下，不同种类的同养生物可能需要共享不同质量的底物(例如，醋酸酯、丙酸酯和其他短链脂肪酸)。

这表明除了先前提出的氢营养伙伴外，还存在能够醋酸氧化和短链脂肪酸氧化的Lokiarchaeota共养伙伴。

我们假设热力学优势和共享代谢物的潜在多样性将推动Lokiarchaeota进行合胞，而不仅仅是个体代谢物交换。

深海archaeota已被证明具有产甲烷和产丙酮的能力，一般来说，与传统产甲烷菌相比，深海古生菌谱系广泛分布于不同的海洋底栖生物栖息地，这可能得益于它们在热力学有利条件下降解多种有机化合物的产丙酮能力。

CR沉积物中氧化底物的氧化还原电位和可用性可能不利于完全产甲烷和相关产甲烷古菌的发生。

实验从深层地下沉积物收集到的样本中发现了古细菌mag，其中一些质量高，完整性好。

许多CR古细菌MAGs，特别是那些属于阿斯加德宿主真核生物特征的，能够降解脂肪和芳香烃，并与代谢多样化的共生生物建立了假定的伙伴关系。

这些环境条件包括深海环境中存在高水平的甲基化化合物(例如甲基化胺)，以及缺乏回收这些甲基化化合物并将提取的甲基直接运送到Wood-Ljungdahl途径所需的专用途径。

在这些CR沉积物中，不同的环境条件可能捕获了产丙酮和产甲烷生活方式之间的中间过渡。

参考文献

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