文丨不知名帅宝

编辑丨不知名帅宝

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前言

利用低温电子断层扫描和亚断层分析的进步来可视化肺炎支原体内部翻译的结构动力学。为了详细解释功能状态，首先获得所有翻译核糖体的高分辨率细胞内平均图，并为肺炎支原体建立原子 模型显示核糖体蛋白明显延伸的核糖体。分类解决了种在构象和组成上不同的核糖体状态。

这些概括了先前在体外解决的主要状态，并反映了主动翻译过程中的中间体。在这些状态的基础上，在天然细胞内激活翻译延伸，并展示抗生素如何重塑细胞翻译景观。在翻译延伸过程中，核糖体通常以特定的三维排列方式组装以形成多核糖体。

通过映射翻译核糖体的细胞内组织，表明它们与多核糖体的结合涉及由核糖体蛋白L9介导的局部协调机制。建议多核糖体中L9的扩展构象减轻碰撞以促进翻译保真度。的工作证明了在细胞内的原子细节处可视化分子过程的可行性。

通过信使RNA将遗传信息翻译成蛋白质是由核糖体完成的，核糖体是细胞中最原始的大分子机器之一。核糖体由一个小亚基和一个大亚基组成，它们在它们的界面形成氨酰基、肽基和出口转移RNA结合位点。

翻译过程可分为四个阶段：启动、延伸、终止和回收,在延伸阶段，核糖体经历一个基本循环，向新生肽链添加一个氨基酸，可分为三个步骤：解码、肽基转移和易位。这些步骤涉及核糖体的结构变化，包括亚基旋转、延伸因子关联和tRNA调节。

根据低温电子显微镜和计算图像分类得出的结构，已经确定了延伸周期中的许多中间体大多数可用的结构都是从模型细菌中分离出来的核糖体，并且经常被抗生素、GTP类似物或突变困在特定状态。缺乏对本地细胞环境中翻译过程的详细结构描述。

尽管通过低温电子断层扫描可以在细胞内观察到主动翻译的核糖体，但之前研究中生成的图仅限于纳米尺度的分辨率，最近开发了用于cryo-ET的图像处理算法，可以将停滞的核糖体分解为基因组减少的细菌肺炎支原体内的 残留水平。利用这些技术进步对核糖体进行大规模结构分类和空间分析，以将肺炎支原体内部的部分翻译过程作为原核最小细胞模型进行非常详细 的可视化。

肺炎支原体核糖体的细胞内结构

为了研究翻译机制的结构细节，通过对完整肺炎 支原体细胞的冷冻电子断层图中检测到的所有核糖体进行平均，获得了3。5-Å共识图。对30S和50S亚基的重点改进提高了图谱质量，并揭示了良好分辨的核糖体RNA碱基和核糖体蛋白氨基酸侧链。

高分辨率的细胞内共识图使能够从头构建M的原子模型。 肺炎球菌核糖体。该结构显示出与其他细菌核糖体的高度相似性，但也揭示了几个新特征。具体而言，与大肠杆菌相比，肺炎支原体的52种核糖体蛋白中有11种具有扩展序列。

大多数这些延伸被预测为无序的，但核糖体蛋白S6、L22和L29的延伸形成二级结构并建立在模型中。发现这种扩展在整个细菌王国中很常见，可能代表了适应不同环境和生活方式的核糖体多样性。

尽管这些延伸的功能在很大程度上仍然难以捉摸，但它们的破坏会影响肺炎支原体 中的细胞适应性或存活。高分辨率核糖体图谱和源自完整肺炎支原体的原子模型 为详细研究核糖体在细胞内翻译过程中的构象和组成变化提供了基础。

细胞翻译的结构动力学

为了分析与细胞内翻译过程相关的结构变化，对来自356个天然细胞断层照片的101,696个核糖体进行了计算分类，并获得了13个不同的核糖体类别。根据延伸因子和与核糖体结合的tRNA，以4到10Å的分辨率确定的十个类别被分配到翻译延伸阶段。

其余三类代表具有单个P/E位点tRNA的70S、与核糖体回收因子复合的50S和游离50S亚基。延伸阶段内的十个类别占检测到的核糖体的70%，这与活细胞内的大多数核糖体参与延伸阶段的预期一致，延伸阶段的持续时间比起始、终止和回收阶段5、25长得多。

可以对已识别的伸长类进行排序以重建平移伸长周期。通过将的肺炎支原体核糖体原子模型灵活地拟合到 分类图中，获得了描述核糖体复合体构象和组成变化的伪原子模型，包括30S身体和头部的旋转，协调延伸因子、tRNA通过A-P-E位点的运动和L1茎的动力学。

每个类别中核糖体的数量提供了翻译延伸中间体的相对丰度，它们共同反映了由它们在细胞内形成和消耗的相对速率决定的稳态分布。经典的、非旋转的“A、P”状态是人口最多的，并且以最高分辨率确定，显示出mRNA、tRNA和新生肽的清晰密度。

在以下状态中，观察到A位点和P位点tRNA振荡进入混合A/P和P/E状态，并伴有30S亚基旋转和L1茎运动,与体外研究一致，沿着这条轨迹，还确定了部分混合“A*，P/E”状态，在混合P/E位点中具有旋转的30S和deacyl-tRNA，但在A位点中仅略微重新定位了肽基-tRNA，类似于先前报告的易位前H2*状态。

当在这个轨迹的背景下观察时，“A，P”状态的高度富集可能表明亚基间旋转代表了肺炎支原体 翻译延伸的限速步骤。鉴于整个延伸周期，导致有效易位的进行性亚基间旋转需要延伸因子EF-G的结合。

值得注意的是，发现EF-G在部分杂交或完全杂交状态下与核糖体结合。与完全混合状态相比，部分混合状态中的EF-G扩展较少，其域IV不与A站点重叠。这种EF-G结合的部分杂交状态类似于磷酸盐释放之前的早期易位中间体。

在接下来的完全混合状态中，由于整个EF-G的旋转及其域间重排，EF-G的结构域IV向A位点延伸约20Å。接下来的第8类显示了30S身体的反向旋转，30S头部旋转的最大幅度，完全延伸的EF-G和嵌合的'ap/P,pe/E'tRNA。

表明它是一个晚期易位中间体，证明了在细胞内主动翻译延伸过程中，从早期到晚期易位阶段存在连续中间体。还确定了两个EF-Tu相关结构，有和没有E位点tRNA。这表明EF-Tu•tRNA与核糖体的结合和E位点tRNA的解离彼此独立。

“P、E”类的丰度相对较低，这表明E位点tRNA不稳定，易位后往往会迅速解离。这与之前显示E位点tRNA快速释放的单分子荧光研究一致，并有助于解决关于其解离时间点的长期争议。这些结果概括了翻译延伸的主要步骤，这些步骤已通过受控体外研究定义，并重建了细胞内延伸周期的结构动力学，突出了核糖体复合物催化的反应的各种可能路径。

根据这些结果，可以导出中间状态出现的概率图，以说明细胞中平移延伸的假定能量景观。翻译的能量景观被认为是崎岖不平的，这取决于Mg2+浓度36、37、EF-G34的存在等因素，38度，温度8度。

在肺炎 支原体中，核糖体、翻译延伸因子和底物的细胞内浓度比大肠杆菌 低十倍。翻译的能量景观可能因不同的生物体、细胞类型和条件而异。将此处介绍的分析应用于其他细胞类型和条件可以加深对本地细胞环境中翻译过程的理解。

抗生素改变翻译环境

核糖体是抗生素最重要的目标之一，众所周知，许多抗生素会通过稳定过程中的某些中间体来阻止翻译。为了研究抗生素对细胞翻译机制的影响，分析了使用两种代表性核糖体靶向抗生素短时间处理的细胞中的核糖体：Cm，它与肽基结合转移中心位于50S亚基，抑制肽键形成;和Spc，它与​30S颈部结合并阻断易位。对抗生素处理过的细胞的亚断层分析产生了17个核糖体图谱，并表明翻译景观被不同的抗生素显着重塑。

在Cm处理的细胞中，72%的70S核糖体被困在“A、P”状态，这是由于抑制了肽基转移39。Cm分子在其规范结合位点中得到解析。值得注意的是，28%的核糖体被发现处于其他几个延伸状态，在主要的“A、P”状态之前或之后。EF-Tu•tRNA结合状态的存在让人想起其他抗生素以类似方式抑制肽基转移的作用。

Spc被建议通过阻断30S亚基的头部旋转来抑制易位14,28,42。发现67。5%的70S核糖体在Spc处理的细胞中停滞在“EF-G、A/PSpc、P/E”状态，这种状态类似于易位前的“EF-G、A/P、未处理细胞中的P/E'状态。

该分子密度在30S颈区域内的螺旋附近清晰可见，与其报道的结合位点一致14、42。这些结果表明Spc通过阻碍30S亚基的动力学来抑制易位。与Cm类似，可以用较低的频率检测处于三个额外延伸状态的核糖体。

与细菌细胞翻译功能相关的其他分子通路的扰动也会影响翻译景观；被假尿苷霉素(PUM)阻滞的RNA聚合酶可以物理阻断核糖体中的mRNA易位，核糖体在转录-翻译偶联过程中与之碰撞。

在PUM处理的细胞中发现59。5%的70S核糖体处于“EF-G、A/PPUM、P/E”状态，这类似于未处理细胞中的易位前“EF-G、A/P、P/E”状态和Spc处理细胞中停滞的“EF-G、A/PSpc、P/E”状态。发现PUM停滞的RNA聚合酶物理阻碍mRNA易位和Spc化学阻碍30S头部动力学导致相似的结构进一步证实mRNA易位和30S旋转直接耦合。

观察到抗生素治疗会导致其特异性结合无法预期的轻微状态，这促使研究可能的细胞间变异性对抗生素的反应。根据在天然和抗生素处理条件下的577个单细胞断层图中的平移伸长曲线进行了聚类分析。

该分析根据四个治疗组产生了四个主要簇，证明了每个簇内的小细胞间变异性。的结果表明细胞中的翻译景观被特异性结合核糖体以及其他目标的小分子全局重塑。在抗生素治疗下存在轻微的伸长状态让人想起之前的研究，这些研究表明在抗生素治疗的细胞中正在进行缓慢的翻译和背景依赖性抑制。例如，Cm抑制受新生肽的特定残基影响。

大多数抗生素，包括Cm和Spc，已知会抑制细胞生长但不会立即杀死细胞。抗生素重塑翻译景观可能会导致蛋白质合成失衡，从长远来看，这会对细胞产生不利影响。

参考文献

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