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细胞凋亡是受基因调控的细胞主动的程序性死亡。

随着细胞凋亡研究的深入,已发现许多细菌感染能触发或抑制细胞凋亡。

目前国内有关细菌L型的研究日益深入,L型与慢性,反复再发性感染的关系的研究报道日见增多。

细菌变成L型后,其生物学性状发生了许多改变,具有类似病毒的特征。

已知病毒感染在致细胞凋亡中起着重要作用。

细菌及其L型感染是否也能引起细胞凋亡,本文用痢疾杆菌D15及其L型分别经口感染小鼠,运用末端转移酶作原位缺口末端标记(Terminal-deoxynuclentidy1 transferase mediated d-UTP nick end labeling.)检测肝、肠等组织的凋亡细胞。

结果如下。

材料与方法

菌种

痢疾杆菌D15株,由福建医科大学微生物学教研室提供。

D15L型,按文献诱导与稳定。

用无菌生理盐水分别将细菌型,L型的24h平板培养物洗下,配成10亿/ml的悬液。

培养基

原菌培养用普通营养琼脂平板,中国蓝平板,L型培养用改良Kagan培养基或肠道杆菌L型选择培养基ELSM。

实验动物

C57BL/6J小鼠。

由安徽医科大学实验动物中心提供。

取6～8周龄、体重为18～22g小鼠30只,雌雄各半,随机分成3组,每组10只。

A组:痢疾杆菌D15感染组,每天每只经口灌注0.5ml菌液,连续12d。

B组:痢疾杆菌D15L型感染组,灌注时间及次数同A组。

C组:生理盐水对照组:每天灌注无菌生理盐水0.5ml/只。

于实验第13d处死动物。

实验观察

细菌学检查

取死亡小鼠结肠或回肠、剪开、用内侧肠腔面直接涂布于肠道L型培养基和普通营养琼脂平板及肠道选择性培养基上。

37℃孵育24h,观察有无细菌及L型生长。

组织学检查

取死亡小鼠的肝脏、心脏、肠、脾脏、肾脏、脑、胆囊、肺、胃组织。

用 10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,贴于洁净的载玻片及多聚赖氨酸处理过的载玻片上,分别作HE染色及凋亡细胞检查。

凋亡细胞检查

主要试剂

脱氧核糖核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase.TDT),生物素标记的dUTP (buo-11-dUTP),购自上海华美公司。

链霉卵蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase.SP)免疫组化试剂盒,购自福州迈新公司。

检查方法

采用Gavrieli的原位缺口末端标记法。

染色程序:①切片常规脱蜡,梯度乙醇水化;②蛋白酶K,37℃,15min;③2%双氧水甲醇,5min;④TDT缓冲液,室温,15min;⑤置TDT酶/生物素-dUTP混合液中,37℃,1h;⑥TB液终止,15min;⑦10%羊血清,37℃,10min;⑧加酶底物-显色剂,15min;⑨苏木素衬染,30s;(10)常规脱水,吹干,中性树脂封片。

除第4步外,其余各步均以PBS液振洗3次,每次3min。

阳性细胞计数

阳性标准为细胞核呈棕色,背景清晰,用高倍镜(10×40倍)计数每个视野的阳性细胞数,每份标本计数100个视野,求出每份标本的阳性细胞均数。

统计学方法:

采用配对χ2检验,秩和检验。

大体观察

A、B两组肠道均见有明显的充血、水肿、积液。

细菌检测结果

A组中有9只小鼠的肠道中分离出痢疾杆菌D15,5只分离出D15L型;B组中3只分离出原菌D15,8只分离出D15L型;而C组中无论在中国蓝平板或L型平板均未离出致病菌,肠外其它组织未能检出痢疾杆菌或其L型。

结果见表1。

表1 各实验组小鼠痢疾杆菌及其L型培养结果

疾理学检测结果

HE染色结果

光镜下结肠标本:A组小鼠结肠肠壁有浅表糜烂现象,见多数结肠似有分泌物附着,肠腔内可见较多的无定型物,肠粘膜表层上皮脱落退变,至使粘膜明显变薄。

B、C两组小鼠肠腔内粘膜脱落细胞较少,肠上皮细胞浆、核均无明显改变。

低倍光镜下小肠标本:A、B两组小肠绒毛清晰,绒毛尖端单层柱状上皮细胞膜轻度肿胀。

而以高倍镜观察,可见绒毛顶部细胞有轻度肿胀,部份染色质有边集趋势,少数核固缩,并见个别核碎裂现象。C组基本正常。

镜下肝脏标本:光镜下见A,B两组小鼠的肝小叶、肝血窦等基本结构存在,但在肝小叶内、小叶间及汇管区血管周围均有灶性淋巴细胞浸润,在一些炎性病灶内可见个别肝细胞核固缩或碎裂,胞浆嗜酸性增强现象,核染色质边集或呈新月状,这些形态学改变,符合HE染色光镜下凋亡细胞的形态学特征。C组则无改变。

A,B两组的肝、脾、肾、胃、肺组织经HE染色镜检还可见有间质性炎症。

对照组各组织均未见明显病理学改变。

凋亡细胞检测结果

结肠:A、B两实验组结肠粘膜表面的柱状上皮层显著变薄,肠腔内脱落物多见,原位末端标记的结果未见肯定的凋亡阳性信号,C组无凋亡阳性信号。

小肠:A、B两组小肠粘膜表面的绒毛尖端柱状上皮细胞和其体部均检出明显的凋亡阳性信号。C组无凋亡阳性信号。

经多样本两两比较的秩和检验认为;A与C组间致小肠绒毛上皮细胞凋亡的差异有显著性(P<0.01)。

肝脏:A,B两组肝组织内均出现散在或小灶性阳性,信号一般位于细胞核和/或细胞浆。并且A组阳性信号明显多于B组。C组:未见肯定的凋亡阳性信号。

统计后发现;3组小鼠肝细胞凋亡检测结果,A组与C组之间差异有显著性(P<0.01),

表2 实验组小鼠各脏器组织中间质性炎症发生情况(N)

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

细菌L型是否有致病性,曾一度引起争议,目前国内外学者已研究证明,L型仍有一定的致病性,但较弱。

细菌L型变后,失去细胞壁,这会导致细胞壁上致病因素的丢失,但L型仍可产生一些毒素或胞外酶,有些细胞膜亦有一定的致病性,细菌L型的致病特征为间质性炎症,与病毒、支原体等无壁微生物相似。

本实验结果显示,D15L型感染组,在肝脏,脾脏,胃、肺等脏器组织均可引起淋巴细胞浸润为主的间质性炎症。

这与L型的致病特征相符。

本实验用痢疾杆菌及其L型分别感染小鼠,均可引起肠粘膜上皮细胞、肝细胞凋亡。

大剂量的致病菌或其L型的“强刺激”可致大肠粘膜上皮细胞中酶的活性被毒素等毒性物质抑制,细胞膜迅速破裂、胞浆结构崩解,细胞核碎裂,细胞脱落坏死。

而在小肠,绒毛尖端上皮细胞凋亡信号多于正常对照。

这可能是因为痢疾杆菌主要定位于大肠,对小肠影响较小,而由于较小的影响(弱刺激)则可能激活上皮细胞,使其表达一种前凋亡蛋白(Bax),使细胞倾向凋亡。

在肝脏:原菌引起的凋亡细胞数多,而其L型相对较少,这可能是L型细胞壁缺失,使致病作用明显降低。

诱导靶细胞凋亡是机体炎症反应的一部分,就凋亡本身而言,它可能是多种因素促成的,但其中可能有某种因素起主导作用。

本实验发现原菌及其L型均可诱导凋亡,L型诱导细胞凋亡的机制可能有如下几个方面:①已知细胞凋亡受基因控制,并称决定细胞凋亡的基因为死亡基因如P53,TNF基因,fas/APO-1,C-myc等。

本实验细菌变成L型后,像普通细菌发生L型变异一样,其生物学特性也发生了重大变化,具有许多类似病毒的特征。

D15L型变后可能象病毒一样进入肠粘膜上皮细胞并与之发生基因重组,干扰这些细胞的正常代谢,诱导凋亡基因活化,引起细胞凋亡。

其侵入肝细胞的机制可能为:在肠道D15转变为L型的过程中,由巨噬细胞携带或通过某种其它途径使微小的L型渗入基底膜毛细血管中,通过血流到达肝脏,与肝细胞发生基因重组,改变了肝细胞的代谢途径,引起肝细胞凋亡。

也可能是细菌L型释放的一些内毒素,扩散入血后,流经肝脏,在肝脏的解毒过程中与肝细胞相互作用,引起肝细胞凋亡。

细胞凋亡究竟是由L型-肝细胞整合作用还是由内毒素的作用引起,或两者均参与,还值得进一步研究。

②有学者报道细胞毒性T细胞(CTL)可促使靶细胞发生凋亡,CTL产生的TNF通过激活Z+2nn+2敏感的核酸内切酶导致细胞DNA裂解。

本实验原菌及其L型感染均有淋巴细胞、单核细胞浸润,淋巴细胞中的CTL可能是致粘膜上皮细胞、肝细胞凋亡的原因。

③Cheesemen KH和Halliwell B均通过实验证实氧自由基不仅可以攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸,还可以和蛋白质及酶发生反应,引起蛋白质变性和酶活力丧失,并影响受体和膜离子通道,导致细胞凋亡。

Weitzman SA和Wisemen H进一步认为:氧自由基可以引起DNA链断裂,再与DNA上的碱基发生加成反应,从而引起基因突变,导致细胞凋亡。

本实验的感染菌及其L型均可引起不同程度的炎症反应,尤其是巨噬细胞在吞噬病原微生物过程中引起呼吸爆发,产生大量氧衍生的自由基如丙二醛MDA,H2O2,O2-,单线态氧等,这些产物不仅具有杀菌作用,同时还可引起细胞器破坏,从而使感染细胞凋亡。

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