前言

膜转运蛋白包括溶质载体超家族，在吸收小分子物质如细胞营养物质葡萄糖和氨基酸方面发挥作用。内质溶酶体通路对于细胞摄取多种不溶性和大分子材料如蛋白质和脂肪酸营养物质也是必要的。

孔形成蛋白在各种结构折叠家族中广泛分布于所有生命界。PFPs长期以来一直被认为是微生物感染的孔形成毒素或宿主免疫执行器。气溶胶素是一种细菌β桶状孔形成毒素。在各种动物和植物物种中，已经发现了多样化的气溶胶素家族PFPs。

一 βγ-CAT复合物的组成及生物功能

在大蟾蜍中发现了BmALP1的气溶素家族PFP，它与三叶蛋白因子BmTFF3相互作用，形成了βγ-CAT的膜活性PFP复合物。这个蛋白复合物双重受体结合模型，针对细胞质膜中脂质筏中的酸性糖脂进行靶向作用。

它内质溶酶体系统促进细胞外物质和质膜组分的进出。这种PFP能够寡聚形成直径约为1.5-2.0纳米的通道，位于内质溶酶体上，方便这些细胞内细胞器与细胞质之间的物质交换。βγ-CAT复合物是多功能PFP，在 maxima中根据不同的细胞环境和环境信号发挥各种生理作用。

βγ-CAT促进了含有蛋白营养物质的囊泡。这些特定的囊泡与溶酶体融合，以水解进口的蛋白质，所产生的氨基酸产物则释放到细胞质中，以支持饥饿状态下细胞的营养供应和能量供应。

诱导特定的细胞内囊泡，其中含有进口的细胞外物质。例如带离子的水和结合白蛋白的脂肪酸，外泌体释放出细胞，实现水和组织实质细胞营养物质的细胞间传递。

maxima中的af-PFPs含有一个保守的C端半胱氨酸，氧化原反应成为关键的调节位点。BmALP1二硫键交换被BmALP3氧化为高分子量的水溶性聚合物，负调节βγ-CAT复合物的组装和生物学功能。

在筛选潜在的βγ-CAT相关蛋白时，发现免疫球蛋白Fc结合蛋白与蟾蜍 maxima皮肤分泌物中的βγ-CAT亚基物理交互。FCGBP具有原氧化的BmALP1的能力，并作为BmALP1与BmTFF3相互作用形成βγ-CAT复合物的支架。 过氧化物酶6和硫氧蛋白恢复并增强了FCGBP对βγ-CAT组装的作用。

βγ-CAT相互作用的蛋白质，对 maxima皮肤分泌物进行了蛋白A柱纯化，分别与多克隆抗体进行免疫共沉淀实验。比较多克隆抗体和兔IgG耦合的蛋白A柱的产物，发现了一些蛋白带。βγ-CAT间接或直接相互作用的未知蛋白质LC-MS方法被鉴定并列为可能的候选者，具有高丰度和氧化原酶。

FCGBP的半定量PCR显示，该mRNA具有组织分布模式，且在皮肤和肠道中丰富表达。FCGBP在人和小鼠的粘膜表面和外部分泌物中广泛表达，也分布在分泌系统中。FCGBP与βγ-CAT的亚基BmALP1和BmTFF3在各种组织中共同表达，特别是在蟾蜍皮肤中高表达，与βγ-CAT的表达一致。

二 FCGBP在βγ-CAT复合物组装中的作用

确定了BmALP1的肽段。生物层干涉法显示，FCGBP和βγ-CAT具有强的分子相互作用，KD值高达2.12×10-8 M。这些发现表明FCGBP与βγ-CAT亚基存在相互作用，提示在蟾蜍皮肤分泌物中新鉴定的FCGBP可能参与βγ-CAT的组装和生物学功能。

FCGBP在B. maxima皮肤中非常丰富。为了更好地了解FCGBP的分子特性和功能，将maxima皮肤分泌物分离在 G-100柱上。在原的SDS-PAGE中，它能够断裂成不同的片段，并且质谱鉴定。

maxima皮肤转录组和蛋白质组的数据分析表明，FCGBP是由1774个氨基酸组成的，理论分子量为195.25 kDa。FCGBP的结构域与人类FCGBP相似，包括N端的IgG Fc结合结构域和由von Willebrand型D、C8半胱氨酸富含和胰蛋白酶抑制剂样结构域组成的四个重复单元。

序列比对表明，该蛋白与人类FCGBP共享35.4%的序列同源性，表明脊椎动物中FCGBP的保守性。FCGBP序列共享两个自动切割位点GDPH，分别位于氨基酸445-448和845-848，这些位点自身催化裂解产生不同的片段，并由二硫键连接。

在maxima中已经鉴定出βγ-CAT的BmALP1亚基的一个副本。这两个β-PFP在它们的C端区域包含一个保守的半胱氨酸，在鱼类到爬行动物的脊椎动物β-PFPs中也高度保守。BmALP3同源二聚体二硫键的连接将BmALP1氧化成它自己的同源二聚体以及水溶性的高分子聚合物，这导致βγ-CAT复合物的解离和失去其生物活性。

溶血活性是存在生物活性的βγ-CAT复合物的指示，这是一种最好和最快的检测方法。BmALP3以剂量依赖的方式抑制了βγ-CAT的活性。BmALP3对βγ-CAT溶血活性的负性调节作用可以被FCGBPs剂量依赖地恢复，而单个FCGBP没有溶血活性。

三 FCGBP促进βγ-CAT复合物的组装及功能的恢复

在存在10和30 nM的FCGBP时，溶血活性分别恢复了27％和36％。仅加入rePrdx6或reTrx而非FCGBP不能恢复βγ-CAT的溶血活性，即使剂量高达约3.1μM。使用Western blot检测了BmALP1单体的产生。在FCGBP存在的情况下，显著观察到BmALP1单体条带。FCGBP能够逆转BmALP3对抑制作用并恢复复合物的溶血活性。

在采集和分离过程中，由于存在BmALP3，一部分BmALP1被氧化成BmALP1聚合物，这些聚合物出现在蟾蜍B. maxima皮肤分泌物的采集样品中。一系列纯化步骤，包括凝胶过滤、阴离子交换和亲和层析，分离出了自然的BmALP1聚合物。

在溶血试验中，约21μg/ml的分离自然聚合物没有表现出溶血活性，BmTFF3本身和天然聚合物与BmTFF3混合物也没有任何溶血活性。在BmTFF3存在的情况下，加入不同浓度的FCGBP后，溶血活性呈剂量依赖性增加，这也被抗βγ-CAT抗体所阻断。

对细胞膜具有传统的形成孔的活性，预混合不同浓度的FCGBP、BmTFF3和BmALP1聚合物，并加入120 mM荧光素封装的0.1 μm脂质体，在低浓度下荧光发射，导致染料释放。当加入150 nM的FCGBP时，最大平均荧光强度测量值达到76.8％。

在518 nm发射时，表明活性βγ-CAT的生成。活性的βγ-CAT可保护宿主免受微生物感染。评估了小鼠内的FCGBP活性。小鼠腹腔液中的细菌计数表明，注射FCGBP、聚合物和BmTFF3的小鼠对E. coli的清除作用显著，并且活性βγ-CAT注射小鼠作为阳性对照，这表明FCGBP组装了活性以刺激小鼠的抗菌免疫反应。这些发现表明，FCGBP将聚合物原成活性。

评估了Prdx6和Trx在BmALP1多聚物原和复合物形成中的可能作用，采用与FCGBP相同的条件进行测试。与FCGBP的积极效应不同，在使用浓度高达3.1 μM的重组Prdx6或Trx的情况下，既未检测到BmALP1多聚体的原，也未检测到βγ-CAT的溶血活性，氧化原酶不直接原氧化的BmALP1。

细胞膜以其选择性通透性形成了细胞质和胞外环境之间的分界，限制了分子之间的交换。南美巨蟾蜍PFP复合物βγ-CAT是一种分泌型内溶酶体通道蛋白，它已进化成为促进细胞营养和水分的获取以及跨细胞膜的转运，并在免疫防御方面发挥作用。

考虑到βγ-CAT在南美巨蟾蜍中的主要功能，必须存在内源性因素来调节这种PFP复合物的组装和解离，以确保其具有特定和可控的生物学作用。研究揭示了 α亚单位BmALP1的内源性同源物BmALP3作为βγ-CAT的负调节因子，它依赖环境氧张力来调节蛋白复合物的解离和功能丧失。

四 FCGBP调节βγ-CAT复合物的机制

类黏蛋白的FCGBP在包括人类在内的脊椎动物中广泛保守。该蛋白广泛表达于黏膜表面和外部分泌物中，由于缺乏抗-FCGBP抗体，制备了自制的抗-FCGBP抗体用于功能实验。有助于PFP复合物βγ-CAT的形成。

共免疫沉淀、拉下实验和BLI，所有结果都显示FCGBP与βγ-CAT之间存在物理相互作用。FCGBP逆转了BmALP3对βγ-CAT的抑制作用，Prdx6或Trx并未逆转BmALP3对βγ-CAT的抑制作用。减少了自然存在的BmALP1聚合物，导致在BmTFF3存在的情况下出现βγ-CAT活性。

荧光素染料释放实验和体内实验证实了FCGBP降解聚合物和组装βγ-CAT的效果。加入FCGBP恢复了长期保存后丧失大量活性的纯化βγ-CAT制备的活性。存在FCGBP和BmTFF3的情况下，重组BmALP1聚合物被降解并形成生物活性的βγ-CAT复合物。FCGBP具有降解BmALP1并作为组装活性βγ-CAT的支架的能力。

FCGBP是一种粘液样蛋白，含有由vWD、C8囊泡蛋白富含半胱氨酸和胰蛋白酶抑制剂类似结构域组成的重复单元，其中半胱氨酸含量非常高，类似于vWF。FCGBP中的vWF结构域含有游离半胱氨酸，可以作为原元素来原BmALP1的聚合物，使其分解成二聚体和单体。

FCGBP提供了一个大的支架，用于结合和稳定原的BmALP1二聚体和单体。BmTFF3与FCGBP结合并与BmALP1相互作用，导致βγ-CAT复合物形成，从FCGBP中释放出来。

随着储存时间的增加，FCGBP制备物原氧化的BmALP1能力显著降低，表明蛋白中的游离半胱氨酸被氧化。Prdx6或Trx恢复了FCGBP原聚合物的能力，并且Prdx6和Trx活性中心半胱氨酸的突变取消了这种能力。

FCGBP作为正调控因子来促进PFP复合物βγ-CAT的形成。荧光素酶封装的脂质体释放实验和体内实验证实了FCGBP减少聚合物并组装βγ-CAT的能力 。FCGBP的添加恢复了长期保存而丧失大量活性的纯化制备的活性。

五 结论

细胞膜是细胞质和细胞外环境之间分子交换的障碍。在蟾蜍中已经发现了βγ-CAT，它是一个由孔形成蛋白和三叶因子BmTFF3组成的复合物。它在各种细胞内或细胞外小囊泡中诱导通道形成，在营养获取、水分平衡和抗原呈递方面起着重要作用。这种蛋白机器应该得到严格的调控。

BmALP3会将BmALP1氧化成水溶性聚合物，导致βγ-CAT复合物的解离和生物活性的丧失。maxima免疫球蛋白Fc结合蛋白，一个保守的脊椎动物粘液样蛋白，是βγ-CAT复合物组装的正向调节因子。

共免疫沉淀揭示了FCGBP、BmALP1和BmTFF3之间的相互作用。FCGBP逆转了BmALP3对βγ-CAT复合物的抑制作用。FCGBP减少了BmALP1聚合物，并在BmTFF3的存在下促进的组装，使其具有生物毒素形成的活性。

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