建立eINTACT新技术，并揭示XopD在宿主植物中的作用机制

2022年12月22日，Nature Plants在线发表了德国图宾根大学Yuan You及其合作者题为“The eINTACT system dissects bacterial exploitation of plant osmosignalling to enhance virulence”的研究论文。该研究建立了可特异性分离含病原体效应蛋白细胞核的新技术eINTACT，并发现黄单胞杆菌效应蛋白XopD可通过调控宿主基因OSCA1.1和脱落酸信号来诱导气孔关闭，从而为细菌生长创造有利的水性空间；揭示了XopD在宿主植物中的作用机制。

https://doi.org/10.1038/s41477-022-01302-y

细菌病原体通过植物的自然开口（如气孔）或伤口侵入宿主，随后在细胞之间或维管组织的质外体空间中繁殖。为了促进侵染，革兰氏阴性细菌使用III型分泌系统（T3SS），将效应蛋白注入宿主细胞。进入宿主细胞后，效应蛋白可通过操纵宿主的细胞过程以抑制免疫和/或创造有利于细菌生长和扩散的环境。最近研究表明，在植物中建立水性的质外体空间对于细菌毒力至关重要。但由于不同细菌属中效应蛋白的多样性，效应蛋白介导的植物侵染及其分子机制，在很大程度上仍是个谜。

黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris）是一种叶维管病原体，可在许多芸苔属作物和模式植物拟南芥中引起黑腐病。XopD是其效应蛋白之一，是一种核定位的III型效应蛋白，含有三个N端EAR和一个C端半胱氨酸蛋白酶结构域。有趣的是，有研究表明，XopD通过抑制叶片的早期坏死以促进疾病，但不影响受感染拟南芥叶片中的细菌生长；且XopD与拟南芥的DELLA蛋白互作并稳定这些蛋白，从而抑制赤霉素GA响应基因的转录。但另一项研究显示，XopD的转基因表达可触发水杨酸SA依赖的防御反应并抑制细菌的生长。因此，XopD在植物体内的精确功能及其分子机制是什么，仍不清楚。

由于细菌仅将极少量的效应蛋白传递到宿主细胞中，从大量感染的宿主组织中捕获依赖于效应蛋白的细胞变化在技术上仍具有挑战性。为了直接分析通过T3SS递送到宿主细胞中的细菌效应蛋白功能，该研究首先建立了一种新技术，特定细胞类型中效应蛋白诱导的核分离（eINTACT），它依赖于效应蛋白对核膜靶向报告基因NTF的转录激活和亲和纯化，可将已接受效应蛋白的植物细胞的细胞核单独分离出来。利用Xcc*AvrBs3接种的eINTACT转基因系，研究人员证明eINTACT系统接近天然感染条件，并可从感染叶片细胞中特异性分离出含Xcc*AvrBs3效应蛋白的宿主细胞核（Figure 1）。

Figure 1. eINTACT可特异性分离含效应蛋白的宿主细胞核

通过在拟南芥叶片中XopD或缺失XopD突变体（∆xopD）的黄单胞杆菌，并进行RNAseq转录组；该研究检测到924差异性表达基因，并显示XopD依赖的宿主基因表达变化至少部分地受到表观遗传的调控，SUVH9和OSCA1.1转录水平的升高可能是由于XopD诱导的启动子去甲基化（Figure 2）。

Figure 2. XopD依赖性的宿主的表观遗传转录调控

OSCA1.1是一种质膜定位的Ca2+渗透型通道蛋白，在拟南芥中充当渗透压感应器。该研究发现，OSCA1.1的缺失会导致叶片枯萎并减少受感染叶片中的细菌生长；表明OSCA1.1对于细菌性疾病和抑制XopD依赖的叶片坏死很重要，细菌效应蛋白靶向细胞中的OSCA1.1转录激活可能促进了宿主的易感性（Figure 3）。

Figure 3. OSCA1.1是细菌致病所必需的

OSCA1.1的转录和翻译上调对其活性都是必需的，但这些仍不足以解释XopD介导的细菌发病机制。研究人员发现转录组数据中有许多差异性表达的基因与脱落酸ABA有关，并利用RT-qPCR证实XopD可促进拟南芥中的ABA信号。该研究进一步显示，XopD可通过操纵渗透压信号来增加宿主细胞的水位，从而促进细菌的生长（Figure 4）。

Figure 4. XopD操纵渗透压来增加宿主细胞的水位和细菌生长

最后，该研究发现XopD能以时空控制的方式诱导气孔的关闭，从而在细菌进入叶肉质外体后增加质外体中的水位，促进细菌的增殖。相反，osca1叶片中的枯萎和坏死症状以及低细菌感染很可能是由于气孔未能关闭引起的；受感染组织的严重脱水无法支持细菌的生长。

综上所述，该研究建立了特异性分离含效应蛋白细胞核的新技术eINTACT，并利用eINTACT揭示了XopD在宿主植物中的作用机制：在黄单胞杆菌感染后期，细菌突破植物的木质部维管进入叶肉的质外体空间；细菌将XopD传递到与质外体和共质体相连的细胞（叶肉细胞、表皮扁平细胞及其邻近的保卫细胞）；XopD可能在其接收细胞中通过它的SUMO蛋白酶活性控制与DELLA互作，从而促进ABA响应基因（如RD29A）的表达，并去甲基化OSCA1.1 启动子以激活其表达；XopD促进的ABA信号和OSCA1.1介导的Ca2+增加，可诱导气孔关闭来创造有利于细菌生长的潮湿空间（Figure 5）。

Figure 5. XopD效应蛋白在植物中的作用机制

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-022-01302-y

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