METAB ENG.-通过糖基转移酶合理设计和人工途径构建大肠杆菌生物合成肉桂醇二糖天然产物

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Biosynthesis of a rosavin natural product in Escherichia coliby glycosyltransferase rational design and artificial pathway construction

”通讯作者为中国科学院天津工业生物技术研究所的孙周通研究员。

植物化学物质是药物和营养剂的丰富资源。获取这些宝贵化合物对于目前是一个重大瓶颈。肉桂醇二糖(rosavin )又称络塞维，是著名药用植物红景天的主要生物活性成分。肉桂基-(6'-O-β-吡喃木糖基)-O-β-吡喃葡萄糖苷 (rosavin E) 是一种天然的络塞维类似物，其阿拉伯吡喃糖单元被其非对映异构体木糖取代，仅从红景天中分离出微量木糖。在此，作者描述了在大肠杆菌中从头生产肉桂醇二糖。将1,6-糖基转移酶CaUGT3转化为木糖基转移酶，用缬氨酸取代T145，将肉桂醇单葡萄糖苷（rosin）转化为rosavin E。通过加入突变体N375Q，酶活性进一步提高了2.9倍。将CaUGT3^T145V/N375Q、根瘤菌1021的UDP-木糖合成酶和rosin生物合成酶合成苯丙氨酸的大肠杆菌中，从葡萄糖合成rosavin E，浓度为92.9 mg/L。通过共过表达拟南芥(AtUXS3)和苜蓿根瘤菌(SmUXS)的UDP-木糖合酶，进一步提高了rosavin E的产量，在5L分批发酵的生物反应器中浓度达到782.0 mg/L。这项工作是通过糖基转移酶工程和人工途径构建生产双糖链天然产物的一个很好的例子。

模型的构建与仿真

尽管植物GTs的序列保守性较低，但它是一个高度保守的二级和三级结构，这有利于利用已发表的x射线结构作为模板对CaUGT3进行同源建模。经过几轮同源建模，经过细化和能量最小化，得到了CaUGT3与UDP-葡萄糖结合的复合物（图2）。为了改变对供体的识别，作者只选择了邻近葡萄糖部分的残基被考虑。其中，位于葡萄糖(<4Å)的6个残基T145、D377、W356、Q378、N375和H24成为突变的候选位点（图2）。残基T145的侧链可能与UDP-葡萄糖的C6-OH形成氢键，这对糖供体的识别至关重要。残基H24和W356被排除在外，因为前者是GT催化的活性位点，后者是一个体积庞大的残基，由于其能够接受相对较小的糖供体，可能有利于识别UDP-木糖。

工程CaUGT3来识别UDP-木糖作为糖的供体

选择T145、D377、Q378和N375进行饱和诱变。诱变文库的初步筛选是在含有粗酶的深孔板中进行。通过对D377、Q378和N375的饱和诱变，均未检测到rosin和UDP-木糖的转化产物。在对T145位点诱变文库的筛选过程中，在HPLC色谱中除了底物rosin外，还发现了一个保留时间较短的新峰（补充图4）。通过HPLC-MS分析(m/z 451.1500++，+446.+997+)，认为该化合物是松香在葡萄糖部分C6-OH处的木糖基化产物(补充图4和5B)。通过以下实验部分的核磁共振波谱分析，进一步证实该化合物结构（补充图3）为rosavin E。与野生型和其他一些T145相关的点突变体相比，T145P和T145V对UDP-木糖的活性更好（补充图4）。因此，这两种突变体被纯化用于体外分析。以5 mM rosin和5mM UDP-木糖为底物，T145P和T145V在30℃反应30 min后，转化率分别为0.9%和3.4%，分别是野生型的4.5倍和17倍（图3）。

随后，以突变体T145V为模板，进行第二轮诱变，对其余三个残基N375、Q378和D377进行位点饱和诱变。经筛选，得到一个双突变体CaUGT3^T145V/N375Q，以UDP-木糖为糖供体，rosin向rosavin E的转化率为8.4%（图3）。当UDP-葡萄糖用作糖供体时，木糖的羟基基团（图4B）。因此，在 MD 模拟过程中，Q375 侧链的氮和氧原子经常与木糖的氧原子相互作用（图 4C）。总体而言，这些关键的相互作用确保双突变体可以容纳 UDP-木糖作为糖供体。

利用工程CaUGT3^T145V/N375Q对各种糖苷进行生物转化

CaUGT3酶对黄酮醇、黄酮、异黄酮等酚类糖苷的各种糖苷具有糖基转移活性。在该研究中，CaUGT3^T145V/N375Q还可以将木糖单位转移到黄酮醇葡萄糖苷（槲皮素3-O-糖苷，补充图6），以及聚糖苷、水杨苷、β-熊果苷、α-糖苷、胃苷、山梨苷和原-糖基苷（补充图6），经HPLC-MS分析证实（补充图7）。

用工程大肠杆菌菌株从头生物合成rosavin E

除了表达工程木糖基转移酶CaUGT3^T145V/N375Q外，还需要rosin和UDP-木糖作为生产rosavin E的前体。rosin已经在苯丙氨酸高产大肠杆菌BPHE中构建了rosin的生物合成途径。UDP-葡萄糖醛酸是大肠杆菌中的一种天然代谢物，可以通过脱羧作用转化为UDP-木糖。在大肠杆菌中选择了苜蓿根瘤菌(SmUXS)的UDP-木糖合成酶转化为UDP-木糖，而不是植物的UDP-木糖合成酶。为了增强前体UDP-葡萄糖醛酸的供应，我们也过表达了天然的UDP-葡萄糖脱氢酶(EcUGD)基因（图5）。

将rosin、UDP-木糖和CaUGT3^T145V/N375Q的生物合成基因结合到BPHE菌株中，得到一个新的菌株BPHE-RETN。以含有野生型CaUGT3的菌株BPHE-RE作为对照。培养48h后，用HPLC法检测BPHE-RE培养液中的肉桂醇和糖基化化合物(图6A)。经LC-MS色谱分析表明，化合物1、2和4分别为rosin（1）、rosavin B（2）和肉桂醇（4）（补充图4）。虽然没有发现rosavin B的摇瓶培养重组应变BPHE-RETN，一个新的化合物（3）分子量为428.1683检测BPHE-RETN培养基，这被确定为rosavin E ，LC-MS和核磁共振分析(图6B，补充图1，补充图5B)。在摇瓶发酵中，BPHE-RETN产生的rosavin E的最高浓度达到92.9±3.6 mg/L，其余rosin和肉桂醇的浓度分别为446.6±32.1 mg/L和96.6±0.9 mg/L(图6C和D)。几乎所有这些化合物都被运输到了细胞外。

流加培养发酵生产rosavin E

为了评价菌株BPHE-RETN的性能，在5L生物反应器中进一步进行补料分批发酵。如图6E所示，在蛋白诱导后的第二个发酵阶段，细胞生长不明显，最大OD值600为27.0。在蛋白诱导后，以计算速率将葡萄糖注入发酵罐，使残留糖保持在5 g/L以上，rosavin E的浓度逐渐升高，72h内最大滴度达到472.9±11.7 mg/L。rosin的剩余浓度在48 h时增加到601.2±23.9 mg/L，然后显著下降。肉桂醇的浓度始终低于100 mg/L。rosavin B与rosavin E一起生产，最高浓度为442.5±6.7 mg/L(图6E)。

进一步的途径工程，以提高rosavin E的产量

将AtUXS3与SmUXS共同过表达，增强UDP-木糖的生物合成，得到重组菌株BPHE-RETN-A （图7）。在摇瓶发酵中，最高浓度达到103.0±1.5 mg/L，发酵液中仍含有379.8±29.8 mg/L rosin和94.1±1.7 mg/L 肉桂醇。在5L生物反应器中补料流加培养发酵过程中，rosavin E的浓度逐渐升高，在72h内达到最高水平，达到782.0±16.3 mg/L。rosin的浓度在36 h时达到287.4±4.9 mg/L，然后在72h时显著下降至6.6±0.2 mg/L。rosavin B的浓度随着rosavin E的增加而增加，在60 h时在415.4±10.1 mg/L时达到最高浓度(图7A，补充图8)。两株重组菌株在72h时的rosavin E、rosavin B、剩余rosin和肉桂醇的浓度如图7B所示。

综上所述，作者报道了通过合理设计糖基转移酶和途径工程，以葡萄糖为碳源生物合成rosavin天然产物的大肠杆菌工程。该研究探索的方法不仅为天然产物提供了绿色、可持续的供应，而且为通过生物转化和合成生物学生产多种酚苷提供了一种新的生物催化剂。

整理：高放

DOI.org/10.1016/j.ymben.2021.10.010