实验基础知识——之"实时荧光定量PCR"

原创：何琪医生

审核：广州中医药大学第一附属医院 王海彬教授

文章所属：王海彬教授团队，转发请标明出处。

一、基本原理

PCR是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA的合成，不断重复可以扩增目的DNA片段，由于新合成的DNA也可作为模板，因此合成量呈指数增长。

而实时荧光定量PCR技术，则是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

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实验步骤：

一、样品RNA的抽提

离心机提前4°预冷

1. 细胞裂解或组织匀浆。a. 贴壁细胞 吸走培养基，6孔板每孔1ml Trizol，12孔板0.5ml b. 悬浮细胞 离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千万细菌，加入1ml Trizol。用枪吹打或适当vortex，确保全部裂解。某些酵母和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。c. 组织 组织剪成小块研磨。每50mg-80mg组织加入1ml Trizol，裂解20min，对于RNA完整性要求比较高的情况，应用液氮保存组织。2. 吹打，室温裂解5min。3. 每毫升Trizol加入200ul氯仿，vortex混匀或剧烈上下震荡15-30s，室温静置3min4. 12000g 4℃离心15min，吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，大约350ul（每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55ml）。5. 按每毫升最初的Trizol加入500ul异丙醇，吹打混匀，室温静置10min。6. 12000g 4℃离心10min，弃上清，（用枪把EP管口出废液吸走），在管底可见RNA沉淀。7. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%无水乙醇(用DEPC水稀释)，不用吹打。8. 7500g 4℃离心5min，弃上清，用200ul枪头吸走管口及盖子液体，用泵头套白色小枪头吸走EP管残余水珠，每个样本需更换枪头)倒扣在卫生纸上静置5min。[或用离心机甩一下（>5,000rpm, 离心1秒），小心吸尽液体]

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二、RNA质量检测

1. 紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。

（1）纯度检测：RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

三、样品cDNA合成

1. 反应体系：一般根据所购买试剂盒操作步骤执行

2. 混合液在加入逆转录酶之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。

3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR

1. 反应体系如下：参照所使用的试剂盒。

2. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

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