李文忠：热敏水凝胶作为微孔用于诱导多能干细胞的生长和控制释放

【摘要】

最近在诱导多能干细胞 (iPSC) 3D 培养中出现的干细胞人工生态位工程为充分利用这些细胞在生物医学应用中的潜力提供了巨大的机会。尽管完全化学定义的生态位环境可以为临床使用提供具有理想安全性的细胞，但在温和条件下为增殖细胞的受控释放建立人工可降解的生态位环境仍然是一个巨大的挑战。

最近，柏林自由大学李文忠博士和Rainer Haag教授团队通过物理-化学共凝胶策略，基于树枝状聚甘油和聚（N-异丙基丙烯酰胺）-共聚乙二醇聚合物，报道了一种先进的可控可释放 iPSC 3D 人工生态位。受益于化学定义的合成材料及其通过共价交联和物理相变的精确配合，基于共凝胶的人工生态位系统可以通过最佳参数进行调整，并具有高细胞生物相容性，以支持高质量 iPSC 的稳健生产。优异的膨胀效率。此外，仅通过调节温度，扩增的细胞就可以可控地从它们的生态位环境中释放出来。总体而言，这种控释水凝胶支架在 iPSC 3D 培养的下游应用中显示出巨大的前景。相关论文以题为Thermoresponsive Hydrogels as Microniches for Growth and Controlled Release of Induced Pluripotent Stem Cells发表在《Advanced Functional Materials》上。

【主图导读】

图1 通过物理-化学共凝胶策略基于 dPG 和 pNIPAAm-co-PEG 聚合物构建的人工生态位的 iPSC 3D 培养工作机制示意图：首先，一组合成前体，dPG-环辛炔，pNIPAAm-co-PEG 合成了叠氮化物和 RGD-环辛炔。1) 与这些前体一起，iPSCs 被播种到系统中，并且它们仅通过化学凝胶化初步产生了一个生态位。2) 转入 37°C 后，也发生物理凝胶化并形成可逆水凝胶。3) 在这些条件下，通过物理-化学共凝胶策略形成了一个稳定的生态位，支持 iPSCs 的生存和快速扩张。4) 培养一定时间后，再次将系统转至25℃，物理凝胶消失，生态位松动，细胞从生态位中释放出来。5) 通过离心收获细胞。

图2 前体的合成和水凝胶支架壁龛的制造过程：a) pNIPAAm-co-PEG-N3 的合成过程及其热可逆水凝胶特性。(NiPAAM:PEG-丙烯酸酯 = 5:1)。b) pNIPAAm-co-PEG-N3 的热可逆相变现象 (LCST ≈ 31 °C)。c) dPG-BCN (6%)、d) RGD-DIC 和e)最终形成的支架壁龛，在 37 °C 下（在 ESGRO 培养基内）具有 iPSCs 培养物。

图3a) 测试具有可变体积比的dPG-BCN与pNIPAAm-co-PEG-N3（cpNIPAAm-co-PEG-N3 = 100 mg/mL）的预制水凝胶的弹性模量 G'和粘性模量 G", cdPG-BCN = 100 mg mL-1) 在恒温 (37 °C) 下。b) 在一定比例 (1:1) 下具有四种不同前体浓度的系统的时间依赖性凝胶化测试。c）不同前体比例下水凝胶生态位的流变数据。d）在一定比例下具有各种前体浓度的水凝胶生态位（凝胶1-凝胶4）的流变学数据。e，f）不同温度下水凝胶生态位不同凝胶化机制的流变学贡献。

图7 基于 dPG-pNIPAAm-co-PEG 小众支架的 3D 培养系统在优化条件下支持 iPSCs 的扩展（比例尺 = 100 µm）。a-c) 分别在第 1、3 和 4 天培养过程中的细胞活力和形态。d,e) 通过活/死染色监测第 1 天和第 3 天的细胞活力测试（绿色 = 活细胞，红色 = 死细胞）。f) iPSCs 在最佳条件下的增殖效率。

图8 从 dPG-pNIPAAm-co-PEG 共凝胶生态位培养系统中控制释放和收获扩增的 iPSC。a) iPSCs 与前体混合并嵌入培养系统并培养一段时间。b) 用 PBS 代替培养基，将培养皿在 25°C (

【总结】

团队开发了一种热响应水凝胶，用于基于 dPG 和 pNIPAAm-co-PEG 聚合物通过物理-化学-共凝胶控制释放 iPSC。这种化学定义的微生态环境支持 iPSC 的强大生产，并具有强大的多能性和自我更新能力。它们的扩增效率分别在培养 3 天和 4 天后分别达到 4.9 倍和 7.2 倍。由于完全化学定义的特性，这种 3D 培养系统可以提供 iPSC，没有任何繁殖限制和病原体和免疫原性转移的风险，这些风险可能是由应用传统的定义不明确的动物源性基质或细胞衍生物引起的。因此，它展示了 iPSC 在下游生物医学应用中保持其全部潜力的巨大希望。此外，团队从优化的物理-化学-共凝胶策略中获得的系统基本上克服了对限定培养基的强烈偏好和坍塌，这是由于仅利用热可逆物理凝胶引起的，并且不足以防止细胞团聚。最重要的是，将热可逆交联引入共价交联网络，为最终的 3D 共凝胶微孔培养系统配备了特定的热可逆降解能力，从而精确地使系统实现膨胀的受控释放。细胞只通过改变温度。这极大地简化了细胞收集过程。总体而言，这项工作提供了一种基于物理-化学-共凝胶策略的先进、受控释放、定义的人工生态位工程方法，在 iPSC 的 3D 培养领域显示出巨大的前景。

参考文献：

doi.org/10.1002/adfm.202010630

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