《AFM》澳洲国立/墨尔本大学：GDNF组织可编程水凝胶

【摘要】

移植的多巴胺能 (DA) 祖细胞的存活和突触整合对于改善帕金森病 (PD) 的运动症状至关重要。然而，人类多能干细胞 (hPSC) 衍生的 DA 祖细胞在植入之前和植入过程中会受到许多压力因素的影响，从而导致存活率低。此外，与胎儿组织移植物相比，hPSC 衍生的移植物显示出较差的可塑性。这些观察结果表明，更有利的宿主环境可能会改善移植结果。

最近，澳大利亚国立大学David R. Nisbet教授、墨尔本大学Clare L. Parish教授团队对DA祖细胞移植物的组织特异性支持提供了一个完全表征的自组装肽水凝胶。这种仿生水凝胶基质经过编程以支持 DA 祖细胞：i) 在基质中包含层粘连蛋白表位；ii) 剪切包裹胶质细胞系衍生神经营养因子 (GDNF) 以确保其持续递送。生物相容性水凝胶使 A9 神经元规格（对运动功能至关重要的 DA 神经元亚群）增加了 51%。GDNF 的持续递送诱导 DA 神经元增加 2.7 倍并增强移植物可塑性，导致 6 个月时运动缺陷的显着改善。这些发现强调了逐步定制组织特异性水凝胶的治疗益处，以改善人 PSC 衍生神经移植的物理和营养支持，从而提高 PD 移植物的标准化、可预测性和功能功效。相关论文以题为Tissue Programmed Hydrogels Functionalized with GDNF Improve Human Neural Grafts in Parkinson's Disease发表在《Advanced Functional Materials》上。

【图文解析】

自组装肽水凝胶制造

如前所述，自组装肽 (SAP) 是使用固相肽合成制造的。创建并筛选了五种肽，以确定支持人类 PSC 衍生的 VM 祖细胞的最佳水凝胶序列。肽序列，如图 1A 所示: 包括：i）苯丙氨酸-苯丙氨酸（FF），ii）异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV），iii）赖氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（KIVAV），iv）亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-缬氨酸-亮氨酸 (LRLVL) 和 v) 酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸 (YIGSR)。

图1 SAP水凝胶生物材料的生成。

鉴定支持移植神经祖细胞存活和调节局部炎症的最佳 SAP 水凝胶

接着，团队评估了每种 SAP 水凝胶支持人类 PSC 衍生的 VM 神经祖细胞移植物存活的能力-替换在帕金森病中逐渐退化的多巴胺神经元所需的细胞群。祖细胞是使用已建立的无异种方案从 LMX1A-eGFP 人类多能干细胞分化而来的。在分化的第 11 天 (D11)，通过底板标记物 FOXA2、前脑-中脑转录因子 OTX2 和神经祖细胞标记物 NESTIN 的共表达验证了培养细胞的适当和有效的 VM 命运规范-在 >85%的细胞中共表达 细胞（图 2A、B）。在移植时 (19 DIV)，77.5% 的细胞表达早期内在多巴胺决定簇转基因 LIM 同源框转录因子 1α（LMX1A-eGFP+；图 2C）。如前所述，为了在移植物中富集 VMDA 神经元，可以通过 FACS（图 2D）轻松分离该群体。

图2 hPSC 衍生的 VM 祖细胞的分化，适用于共植入和筛选基于肽的 SAP 水凝胶。

组织特异性支架提供功能性 GDNF 以促进体外 DA 存活和可塑性

团队评估了 IKVAV SAP 水凝胶在延长的时间范围内维持 GDNF 递送的能力，并在体外影响啮齿动物和人类 VM 祖细胞的行为。重要的是，具有 GDNF 的 SAP 水凝胶的剪切封装对凝胶的组装或机械性能没有影响（图 3A-D）。使用 SAXS 进一步检查 IKVAV 水凝胶和负载有 GDNF 的水凝胶的结构。X 射线散射剖面显示 IKVAV SAP (凝胶) 和 GDNF 加载的 SAP (凝胶+GDNF) (图 3E) 之间没有显着差异。

图3 从 IKVAV SAP 水凝胶递送 GDNF 并确认维持的功能活性。

GDNF 功能化支架促进帕金森病大鼠的功能恢复和移植物存活率

随后测试了 GDNF 剪切封装的 IKVAV SAP 水凝胶是否能够支持 hPSC 衍生的 VM 祖细胞移植物在帕金森病大鼠脑中的长期结构和功能整合（图 4A）。在 6OHDA 损伤（移植前，Pre-Tx）后 4 周对单侧 6OHDA 损伤大鼠的不对称运动功能障碍进行行为测试，并在移植后 24 周重复（图 4B）。所有动物在移植前都表现出旋转不对称（> 6 转 min-1），这种缺陷仅在未移植动物（仅病变）中持续存在 24 周（图 4C）。在用于评估自发运动功能的圆柱体任务中，移植前的所有动物都显示出对侧前爪使用的缺陷（与未受损的同侧爪相比，受损对侧的使用 ≈10%）。只有在 GDNF 功能化 SAP 支架（细胞 + SAP-shGDNF；黑色条）存在的情况下接受移植的动物在移植后 24 周显示出肢体使用的显着改善（图 4D）。

图4 将人 ESC 衍生的 VM 祖细胞与 GDNF 功能化的组织特异性支架一起植入可改善帕金森病大鼠的运动功能。

功能化支架促进 DA 神经元的存活和偏置 A9 规范

神经元核 (NeuN+) 和 HNA+ 的共免疫反应性表明，无论是否存在水凝胶或 GDNF 蛋白，所有移植物中约有三分之一的细胞采用成熟的神经元表型（图 5A-C）。这些神经移植物影响运动功能的必要条件是它们形成成熟的、表达 TH 的 DA 神经元的能力。正如先前报道的 LMX1A-GFP 分离的祖移植物，总移植物的 ≈7% 表达了共表达的 TH（TH+/HNA+）。虽然 GDNF（细胞 + sGDNF）的急性递送或 IKVAV SAP 水凝胶（细胞 + SAP）的存在对 TH+ 细胞数量没有影响，但在 SAP 支架存在下进行移植，维持 GDNF 递送（细胞 + SAP-shGDNF） ，显示 TH+ 细胞增加了 2.7 倍（图 5D-H）。移植物中 DA 神经元的这种增加超过了移植物体积的增加，TH+ 细胞密度显着升高（图 5I)。

图5 功能化支架可增加移植物尺寸、DA 神经元产量和偏置 A9 规范。

参考文献：

doi.org/10.1002/adfm.202105301

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