不同离子液体溶剂衍生丝素蛋白的降解

«——【·前言·】——»

建立一个适当的降解率是对组织工程支架至关重要，本研究通过改变丝素蛋白的分子量(MW)来调控丝素蛋白三维支架的降解速率，丝素蛋白的溶解性主要取决于溶剂对丝素蛋白的离子能力。

我们用LiBr、Ca(NO3)2和CaCl调节丝素蛋白的分子量，以分散丝素蛋白，解开丝纤维，SDS-PAGE分析表明。

氯化钙衍生的丝素蛋白的分子量低于淀化理和硝酸钙衍生的丝素蛋白的分子量。

丝素蛋白体内外降解结果表明，低分子量丝素蛋白制备的支架材料降解更快。

FTIR和氨基酸分析表明，无定形区优先被胶原酶1A降解，而SDS-PAGE和氨基酸分析表明，无定形区被降解成多肚(主要在10-30k Da)和氨基酸。

由于CaCl衍生的支架中含有丰富的低分子量多肚，减少了分子间的缠结和分子链在微晶中的穿越，从而导致支架的快速降解，体内降解实验结果表明：

CaCl2衍生支架的降解速率与真皮再生相匹配，表明丝素蛋白的降解速率可以被有效地调控。

«——【·建立一个适当的降解率·】——»

本研究通过改变丝素蛋白的分子量(MW)来调控丝素蛋白三维支架的降解速率，丝素蛋白的溶解性主要取决于溶剂对丝素蛋白的离子能力。

在研究中我们用LiBr、Ca(NO3)2和CaCl调节丝素蛋白的分子量，以分散丝素蛋白，解开丝纤维。

经过实验SDS-PAGE分析表明，氯化钙衍生的丝素蛋白的分子量低于淀化理和硝酸钙衍生的丝素蛋白的分子量。

体内外降解结果表明，低分子量丝素蛋白制备的支架材料降解更快。

这个降解的原理依据是由于CaCl衍生的支架中含有丰富的低分子量多肚，减少了分子间的缠结和分子链在微晶中的穿越，从而导致支架的快速降解。

体内降解实验结果表明，CaCl2衍生支架的降解速率与真皮再生相匹配，表明丝素蛋白的降解速率可以被有效地调控。

天然SF纤维必须再生和加工成不同的产品，如纳米纤维、薄膜或三维支架，再生、制备和后处理后，孔径、孔隙度和结晶度的变化导致降解速率的变化。

与天然SF纤维相比，再生SF材料的酶降解速度更快，体内长期降解还表明，三维SF支架的降解Be-Havior与制备方法有关(其中支架来自于全水或有机溶剂)，不同的制备工艺导致了不同的孔结构。

在生活中所需的支架降解率取决于特定的组织工程应用，如用于骨组织形成的支架需要缓慢的降解速率，而快速降解则需要用于皮肤组织修复。

到目前为止改变SF支架的形态和品体结构，并不能提供血管组织工程应用所需的不同降解速，聚合物的降解速率也很显著主要受化学成分和分子量的影响分子量的聚合。

«——【·天然丝素纤维在离子液体中的溶解方法·】——»

天然丝素纤维在离子液体中的溶解度取决于阳离子和阴离子破坏丝素晶体中气键的能力。

本研究的目的是研究分子量和丝素降解之间的关系，以调节三维支架的降解速率。

首先，用LiBr、Ca(NO3)和CaCl三种不同分子量分布的SF溶液溶解天然SF纤维，将三种离子液体中的SF溶液冻于制备三维支架。

随后用Col-LagenaselA建立生理模型，诱导体外降解18天，进一步将支架植入SD大鼠皮肤缺损28d，研究其与体内降解的关系。

以湖州桑蚕生丝为原料，在0.05wt%的碳酸钠溶液中于98°C脱胶三次，清洗30分钟。

然后在烘箱中干燥将提取的SF纤维溶于9.3M的浪化鲤溶液中，在60“C+2C条件下溶解2h，钙在100°C+2C温度下反应3小时，并在CaCh；CH，CH，OHH20(1:2:8摩尔比)的三元溶剂。

所得溶出产物分别在去离子水中透析(MWCO9000)4天，过滤后得到SF溶液，然后在4C下储存。

将三种离子液体衍生的SF溶液稀释至2%，然后向SF溶液中加入2-吗咻代乙磺酸(MES)N-轻基琥珀酷亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐。

将混合物倒入不锈钢容器中，在-40C下冷冻6小时，然后使用VirtisGenesis25-LE冷冻干燥机冷冻干燥48小时。

«——【·体外降解·】——»

胶原酶IA(来源于溶组织梭菌，EC3.424.3，sigma-Aldrich，)溶解在磷酸盐中-缓冲盐水(PBS，0.05M，PH74)在10U/ml，将支架切割成正方形(3x3cm，每个时间点n=3)并称重。

再将样品在5ml酶溶液中于37C缓慢振荡下孵育1、3、6、12和18天，并在其他相同条件下在PBS中作为对照在第1、36、48天集降解产物和残留物进行分析，每3天用新鲜的酶溶液更换降解液。

酶降解后，冻千支架并通过扫描电子显微镜(SEM，S-570日立，日本)检查，对于分子构象的测量，傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析使用Nicolet5700光谱仪(美国ThermoScientific公司)进行。

红外光谱进行了分析，在酷胺第一区域(1595-1705厘米)使用Opus6.5软件(Bruker,Germany)使用具有25cm-的半带宽和03的噪声降低因子的洛伦兹线型进行反卷积，红外光谱曲线拟合，以测量酷胺的相对面积区域组成。

样品在5%-15%聚丙烯酷胺凝胶上运行，运行缓冲液(0.25MTris-HCI，10%SDS，05%澳酚蓝，50%甘油和5%2-疏基乙醇，pH83)，堆积凝胶中含有5%的丙烯

在10MTris-HCI缓冲液中加入01%的过硫酸接和01%的SDS(pH值为6.8)，以及梯度分离凝胶含有8~15%的丙烯酷胺，01%的过硫酸镀和0.1%的SDS。

在15M的Tris-HCI缓冲液中预先染色的蛋白质作为分子量标记物(25-200和43-300kDa)用于检测SFMWD值：

凝胶用易染色考马斯蓝试剂盒(Invitrogen，carisbad，CA)染色，降解促进剂管道进行了检查，以分析在降解过程中重新释放的多肤。

对于降解产物的游离氨基酸测定，将5m18%磺基水杨酸溶液加入到等体积的降解溶液中。

然后在15000rpm离心15分钟除去蛋白质，收集的上清液用0.02N盐酸，用Millipore022微米注射器过滤器过滤。

洗涤20mL滤液使用氨基酸分析仪进行分析测定样品中氨基酸的含量降解后保留，样品在6N盐酸中于110C水解24小时然后使用氨基酸分析仪进行分析。

如图2所示(a-0)、(b-0和 (c-0))，三种溶剂衍生的SF支架呈现多孔形态，其中孔形状为不规则多边形和纺锤形，三种支架的孔壁厚度相似。

大孔的长直径约为100-600im，短直径约为50100jm，200um。

从来自(a)溴化锂、(b)氯化钙、(c) Ca（NO3）2的丝纤维蛋白的SDS-PAGE，其中（M1）和（M2）为分子量标记，分离凝胶的浓度为8%。

图2.支架在酶溶液中孵育0、6和18天的扫描电镜图像：(a)Libr衍生支架；(b)Ca（NO3）2衍生支架；(c)CaCl2衍生支架，比例尺= 500 μm，细部毛孔10-100pm。

通过研究确定，三种支架孔径相似。

随着进一步的降解，所有的支架都无法保持完整性和崩溃。

残余的氯化钙衍生的支架是粉末状的，但是剩余的澳化鲤衍生的支架和硝酸钙衍生的支架仍然是片状的(B-18)和C-18的缩写形式)。

结果表明，澳化理来源的支架和Ca(NO，K)来源的支架能够维持更长时间的结构完整性，而CaC来源的支架更容易受到酶的降解。

«——【·质量损失·】——»

图3显示，SF支架的质量损失随酶降解时间的增加而增加，3天后，由LiBr、Ca (NO3) 和CaCl衍生的支架的残余重量分别为90.33%、88.29%和88.29%。

分别为85.68%随着进一步降解，三种支架之间的残余重量差异显着增加。

SF支架降解过程中的定量变化：化衍生支架，Ca(NO)2衍生支架，标记a.b和c分别表示来自LiBr，Ca(NO，b和CaCI-衍生的支架的降解日期的线性趋势。

三条直线的斜率表现出不同的降解速率，而体外降解数据表明，酶降解速率依次为CaCl，-衍生支架>Ca(NO3)>-衍生支架>LiBr衍生支架。

用傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究了SF支架在降解过程中的构象变化，在1651酷胺I和1540厘米酷胺II观察到(图4(a-0)，(b-0)和(c-0)在降解之前，吸附峰在1524Cm-(酷胺II)，代表B片结构，是非常弱的。

这一结果表明，支架降解前的二级结构主要是无规卷曲和a-螺旋。

降解6天后，1651cm-(酷胺1)和154cm-’(酷胺II)处的吸收峰减弱，而1628cm-处出现了特征吸收峰(图四(a-6)(b-6)和(c-6)中的至少一种。

降解18天后，1651厘米和1540厘米的峰值消失，而1628厘米和1524厘米的峰值消失。

相反(图4 (a-18)、(b-18)和(c18))这个观察者Vation表明SF的无规线圈结构降解后支架材料降解率下降，主要影响因素为降解后支架材料的降解，在残余支架中形成P-片结构。

图4.(a)libr衍生支架的FTIR光谱；(b)Ca（NO3）2衍生支架；(c)cacl2衍生支架降解0、6、18天后。

如表1所示，覆盖酷胺I区(1595-1705cm-的拟合结果显示了各种二级结构的含量，降解前，LibrCa(NO3)和CaCl制备的支架的THCp片含量分别为317%、30.7%和30.0%，差异无显着性。

不过随机线圈含量分别为15.9%、174%和215%结果表明SF再生过程对MW和二级结构均有影响在6天后，P片控制器。

用SDS-PAGE分析检测第3、6和18天的降解产物，在各降解阶段均观察到明显的连续条带，表明丝素蛋白支架在降解过程中被降解成多肚，然后释放到酶溶液中，CaClz衍生的扇褶带在低MW区域(10-30kDa)较强。

如图5所示，SF支架可以被胶原酶IA降解为低分子量多肚，并且低分子量多肤(10-30kDa)很容易从Caclz衍生的支架释放到酶溶液中。

«——【·降解残留物及产物氨基酸分析·】——»

家蚕抗菌肚的氨基酸组成主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，表2-3显示Gly、Ala和Ser含量约占总氨基酸级分的84%，降解后，Gly、Ala和Ser主要存在于晶体中。

表一所示：降解0、6、18d后，SF支架的二级结构含量由FTIR光谱的解卷积酷胺I区得到。

表2.降解过程中残留的氨基酸组成和来自LiBr衍生支架的降解产物中的游离氨基酸含量。

将丝素蛋白支架植入SD大鼠真皮组织全层创面28天，研究其在体内降解与相对分子质量的关系，图6显示了H&E染色图像。

表3降解过程中残留的氨基酸组成和来自CaCl2衍生支架的降解产物中的游离氨基酸含量ND：未确定。

SF支架各支架大部分降解，有新生组织长入支架内部，CaCh衍生支架的新组织形成更明显，与正常真皮组织更接近。

使用SigmaScanPro50计算降解率，CaCh衍生支架的降解率为83.8%，高于LiBr衍生支架的降解率66.2%，Ca(NO，)衍生支架的降解率略高。对于澳化理衍生的支架

«——【·关于丝素蛋白支架降解实验的讨论·】——»

丝素蛋白支架的降解速率不仅与丝素蛋白的孔结构和晶体结构有关，而且与丝素蛋白的分子量水平有关。

将天然丝素纤维溶解后得到再生丝素溶液，可以进一步在水溶液中制备具有所需构型结构和功能的生物材料。

示例配置包括3D支架、凝胶、颗粒和纳米纤维，许多离子液体，如Ca(NO)、LiBrCa(NO3/甲醇/Ho,CaCIJetOH/H20和LiSCN。

SF支架在大皮下植入28天后的H&E染色，用于(A)LiBr衍生的支架，(B)Ca(NO，h衍生的支架，和(C)钙调素衍生的支架。

黑色箭头标记的是未降解的支架，刻度尺=100微米;SF支架的降解百分比为(a)化衍生支架;(b)钙(NO,衍生的支架，和c的氯化钙，衍生scaffolds，已成功地用于溶解蚕丝纤维[4-624-26]。

在这项研究中，我们调查了三种离子液体溶剂，澳化理，钙(NO，b和CaCh/EtOHH20，对再生SF的MW级，我们通过改变分子量水平来调节3D支架的降解速率。

«——【·结论·】——»

溶组织梭菌胶原酶LA体外降解模型和全层创面体内实验，均显示不同溶剂对SF支架的降解差异显著，与LiBr和Ca(NO3)2的再生过程相比，Cach衍生SF的分子量较低，降解速度较快。

结果表明：SF支架被降解为多聚肚和游离氨基酸，红外光谱和氨基酸分析表明胶原酶IA优先定位于SF的无定形区，活体实验，结果表明，CaCl-衍生支架是一种较好的支架材料。

真皮组织的再生，由于其更快的降解速度，这些结果对调控未来丝素材料的降解速率以满足各种组织修复的要求具有重要意义。