大戟属植物有什么化学成分？现在对我们有什么作用？应用情况如何

——前言：——

当MDCK细胞生长至对数生长期时，将细胞计数以5×103个/孔的密度接种在96孔板中，孵育于37ºC培养箱中培养24h后，将细胞分成实验组。

病毒对照组和空白对照组，每组设4个复孔，其中实验组加入MOI=1的A/PR/8/34(H1N1)病毒和不同浓度的化合物，病毒对照组加入MOI(感染复数)=A/PR/8/34(H1N1)病毒，空白对照组不做任何处理，培养48h后加入Promega公司的CellTiter-Glo试剂测96孔板的化学发光值。

最后按如下公式进行数据处理：保护率%=(实验组RLU值–病毒对照组平均RLU值)/(空白对照组平均RLU值–病毒对照组平均RLU值)，并用软件计算出IC50值。阳性对照为核蛋白(Sigma-Aldrich)。

体外抑制NO生成活性

(1)实验原理:炎症是当外来病原体和有害刺激物入侵时，人体组织产生自我保护反应的过程，涉及到局部的血管和免疫系统，以及损伤组织中的各种分子介质。

然而，不受控制的炎症可能会引起一系列疾病。人类最严重的疾病是缺血性心脑血管疾病，这些疾病会因炎症失控而导致机体的病理改变。因此，控制炎症介质的级联激活，例如白介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子(TNF)和一氧化氮(NO)的级联激活可能是一种有效的方法治疗炎症性疾病，以及缺血性心血管和脑血管疾病。

当脂多糖(LPS)等炎症因子刺激巨噬细胞时，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)会在细胞中被诱导生成，iNOS通过催化细胞内L-精氨酸分解产生大量NO，引起炎症及相关病变。因此，抑制NO的生成是在抗炎中代表化合物具有抗炎作用的重要指标。

（2）实验方法

A细胞培养：鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7在37°C下在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中培养，该培养基中添加了10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素（10,000U/mL）链霉素（10,000g/mL），然后将细胞孵育在37°C，含有5％CO2的加湿培养箱中。待细胞贴壁达90%左右时用胰酶消化传代。在所有实验中，在进行任何处理之前，使细胞适应24小时。

B体外抑制NO生成的活性筛选

a取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中以10×104个/孔的细胞密度接种于板中，每孔加入细胞悬液100L，在含有5%CO2，37°C恒温培养箱中培养24h。

b待细胞贴壁后，将细胞分成四组，分别为空白组：1‰DMSO+完全培养液；模型组：1‰DMSO+完全培养液+2μg/mLLPS；实验组：化合物+2μg/mLLPS+1‰DMSO+完全培养液的；阳性对照组：L-NMMA+2μg/mLLPS+1‰DMSO+完全培养液。

其中每个测试化合物的浓度分别为3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM。每组含有三个复孔,小心的将残余的培养吸出，然后将不同的培养液和试剂计入到不同的分组中，总体积100L。每个组均控制在2‰的DMSO含量，继续培养24h。

c小心吸取各孔细胞的70μL上清液，加入50LGriessA液，在摇床振摇10min，再加入50μLGriessB液，继续振摇10min；使用酶标仪在570nm处测得其吸光值，NO生成抑制率%=(LPS模型组-实验组)/(LPS模型组-空白组)×100%。

d使用SPSS21.0对数据进行分析处理，计算IC50等。

肿瘤耐药逆转活性的筛选

（1）实验原理:MTT中文全称3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(商品名：噻唑蓝)，是一种用于检测细胞存活和生长的方法。原理如下：MTT是一种黄色染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

细胞中的甲臜可以用DMSO溶解，用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其吸光度，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。这种方法在一些生物活性因子的活性检测中已广泛应用、也经常应用在一些大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性的测定等。

另外，MTT法也可用于抗炎活性筛选过程中化合物对细胞活力的影响，以排除影响抗炎活性的细胞毒因素。它的特点是灵敏度高、经济。

（2）实验方法:将对数期生长的HepG2或HepG2/ADR细胞，加入到含有100μL的细胞悬液的96孔板中，在37°C、5%CO2的培养箱中培养24h，令待测细胞的密度达到10×104个/孔；用MTT法检测HepG2/ADR对于ADR的耐药性。

分别得到ADR对于普通HepG2和HepG2/ADR的IC50值，并计算出耐药倍数。耐药倍数=IC50耐药株/IC50敏感株。计算得到ADR对于耐药株的耐药倍数为99.1倍。

逆转肿瘤耐药株活性实验：取对数生长期的细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后，每孔加入含药物的完全培养基处理48h，其中以不加药物处理为空白对照组，之后，每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液，孵育4h后，每孔加入120μLDMSO，避光震摇15min后于490nm处测其OD值。

其中抑制率%=(空白组平均OD值-实验组OD值)×100/空白组平均OD值。

使用IBMSPSSStatistics20计算样品的半数抑制浓度(IC50)，最后，采用如下公式计算化合物的逆转倍数(ReversalFold，RF)：RF=阿霉素IC50/化合物与阿霉素联合用药IC50。

对HepG2、A549和Hela细胞抑制活性的筛选：

将HepG2、A549和Hela细胞复苏、培养、传代后，细胞培养于37℃、5%CO2的培养基中，培养基由DMEM、1%HEPES(BioFroxx、Hesse、Einhausen)、1%混合青霉素(10000μmL-1)和链霉素(10000μg/mL-1)和10%胎牛血清组成。

简而言之，将细胞(1×105/孔)接种于96孔微孔板中，粘附12h后加入药物。

以顺铂或阿霉素为阳性对照，各细胞系分别给予不同浓度(50、25、12.5、6.25、3.12μM)的样品三次，继续培养48h。细胞存活率通过MTT比色法测定。SpetraMaxM2(美国MolecularDevices)记录光密度(λ=490nm)。根据3次药物的平均OD与浓度曲线计算样品的IC50值。最后采用SPSS21.0软件进行数据评价。

抗胶质瘤干细胞活性筛选

初筛：96孔板用Laminin按照1:100稀释在PBS缓冲液中，按照50L/孔体积进行包被，孵育5h，将GSC-3#-EGFP细胞进行细胞消化，细胞计数，按照2万个细胞每孔的数量，将GSC-3-EGFP均匀的接种在96孔板上，培养体积150l/孔，放置细胞培养箱中，培养20h后，待细胞贴壁，将待筛选组分按照10g/ml终浓度，培养体积200l。

添加到细胞培养板上，在细胞培养箱培养约72h，显微镜下观察记录细胞生长状况，筛选细胞毒性化合物。

复筛：从初筛结果中选出抑制胶质母细胞瘤干细胞活性的组分，进行复筛，96孔板用Laminin包被孵育5h，三株胶质母细胞瘤干细胞GSC-3#-EGFP，GSC-12#-EGFP和GSC-18#-EGFP，小鼠正常神经干细胞(293T和HAC)和人胶质瘤细胞株(U251，U251和T98G)进行细胞消化。

细胞计数，按照20000cells/孔进行细胞接种，放置在细胞培养箱中培养24h将初筛为阳性的组分按照10g/ml终浓度添加到细胞培养板上，继续放置细胞培养箱培养72h，显微镜下观察记录细胞生长状况，筛选对胶质母细胞瘤干细胞有抑制活性，但是对测试的小鼠神经干细胞和人体多株正常细胞均没有抑制活性的组分。

选择性抑制胶质母细胞瘤干细胞组分活性IC50测定：96孔板用50l/孔稀释的Laminin进行包被孵育5h，胶质母细胞瘤干细胞GSC-3#-EGFP，GSC-12#EGFP和GSC-18#-EGFP，人正常细胞株(293T和HAC)和人胶质瘤细胞株(U251，U251和T98G)进行细胞消化，细胞计数，按照2万个细胞每孔进行细胞铺板。

每孔按照150l体积均匀的将细胞接种在96孔板上，放置在细胞培养箱中培养24h，将组分按照最高终浓度80g/ml，往下两倍梯度稀释进行稀释，每个浓度三个复孔进行加药，DMSO为空白对照组，放置细胞培养箱中培养，观察记录细胞生长状况，在加药后72h，将MTS按照1：10比例与培养基混匀后移除原有培养基，按照100l/孔添加，细胞培养箱孵育1-2h，取出在酶标仪上测定490nm处的吸光值，计算IC50值。

——实验结果——

分离与鉴定

综合利用硅胶、ODS-C18、MPLC、SephadexLH-20和制备薄层色谱等现代多种色谱分离手段，以及各种波谱鉴定、分析技术(HRESIMS、UV、1D-和2DNMR、X-ray、计算ECD和计算13C-NMR等)对苦豆子种子部位的氯仿相的生物碱进行富集分离。

从中共分离鉴定了49个喹诺里西啶类生物碱，结构类型包括37个苦参碱型(1-37)，9个鹰爪豆碱型(38-46)，2个金雀花碱型(47和48)和其他类喹诺里西啶生物碱(49)。

其中包括16个新化合物，化合物1-4是从槐属植物中第一次分离得到的C-11位氧化的苦参碱类化合物，新化合物1-15的绝对构型是通过计算ECD和计算13C-NMR确定的，除此之外，通过X-ray单晶衍射进一步确定了化合物4和6的绝对构型。

新化合物分别命名为：SophalodeA(1),SophalodeB(2),SophalodeC(3),SophalodeD(4),SophalodeH(5),SophalodeI(7),SophalodeE(12),SophalodeF(13),SophalodeG(14),SophalodeN(15),SophalodeP(16),SophalodeM(17),SophalodeO(28),SophalodeJ(33),SophalodesK(34)和SophalodeL(35)。

其中，化合物Neosophoramine(6)的绝对构型是通过比较它与化合物SophalodesH(5)的ECD来确定的。

新化合物的结构鉴定

SophalodeA(1)的结构鉴定

化合物1：黄色油状物，通过高分辨质谱HR-ESI-MS(m/z279.2071[M+H]+,计算为279.2067)确定分子式为C16H26N2O2，不饱和度为5。1H-NMR谱显示含有1个甲氧基[δH3.05(3H,s)]和6个特征质子信号[δH4.36(1H,dt,J=12.8,3.7Hz,H-17),2.82(1H,brd,J=11.1Hz,H-2),2.75(1H,brd,J=10.4Hz,H-10),2.33(1H,m,H-14b),2.31(1H,m,H-17)和2.28(1H,m,H-14a)]。

13CNMR和DEPT谱，显示16个碳信号，包括1个羰基(δC170.6),1个氧化季碳(δC89.5),10个亚甲基(δC17.5,24.2,24.4,24.4,27.9,28.6,32.5,40.6,55.5和56.4)和3个次甲基(δC39.4,48.4和65.7）。

以上信息表明化合物1为苦参碱型生物碱，且结构与(+)-Matrine(18)非常相似。最明显的差别是在化合物1中的C-11额外存在一个甲氧基(δC48.9），且导致C-11的化学位移向低场移动。

(δC53.4→89.5）11-OMe的存在也通过OMe和C-11以及H-6(δH1.90）、H-7(δH1.47）、H-8a(δH1.26）、H-12a(δH1.87）、H2-13(δH1.60,1.71)和C-11的HMBC相关得以证实。化合物1的相对构型是通过分析13C-NMR数据和ROESY相关确定的。

在该化合物的13C-NMR数据中，C-3，C-5，C-7和C-9的化学位移与化合物18的13C-NMR数据的存在差异，说明它们在C-5、C-6和C-7具有不同的空间取向。

进一步在ROESY谱中：H-5/H-7,H-6/H-2,H-7/H-10和OMe-11/H-17的一系列相关，说明H-6为构型，H-5,H-7,OMe-11为构型。

该化合物的绝对构型通过计算ECD方法确定，在B3LYP/6-31+G(d，p）水平上，采用TDDFT法对两种可能的对映体(5S,6S,7S,11S和5R,6R,7R,11R)进行ECD计算，结果表明(5R,6S,7R,11S)-构型的ECD谱与实验值吻合较好。从而确定了化合物1的绝对构型为5R,6S,7R,11S，命名为SophalodeA。

我们可以得出化合物优势构象11a-11q的GEPOP和SEPOP分布之和分别>90,所以我们需要对构象11a-11q的各个优势构象进行计算，然后将11a-11q的这个ECD能量求和，再拟合出化合物11-B的ECD图形。