科学家开发原位蛋白结构解析技术，数据采集比传统方法高30-40倍

蛋白质复合物是实现复杂的功能的大复合物。如果将其从细胞中纯化出来，获得的结构可能是不完整的。并且，蛋白质被提取到体外后，周围的环境也发生了改变，活性将会受到影响。因此，直接在细胞中对蛋白质的结构进行解析非常重要。

经过几十年的发展，单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）实现了溶液中的蛋白质结构解析，其分辨率一般接近原子级，甚至在脱铁蛋白上达到原子级分辨率。但是，与纯化的蛋白质对比，蛋白质在处于工作状态的细胞环境下，可能表现出不同的状态，例如普遍存在的原生构象数量上更多。与此同时，还会形成比其更加完整的复合体。因此，在原位解决蛋白质的结构是冷冻电镜的重要目标之一。

低温电子断层扫描通过收集倾转系列的图像来进行断层重构，虽然倾转系列图像的收集可以通过束偏移的数据收集来加速，但其通量仍然是单颗粒数据收集的大约 1/30。因此，断层扫描的数据收集通量对实现高分辨率结构解析来说，是一个尚未解决的问题。

图丨相关论文(来源：Nature Communications)

近日，Nature Communications 上发表了关于冷冻电镜蛋白质成像的最新论文，题为《通过 GisSPA 在伪原子分辨率下确定细胞中的蛋白质结构》（Determining protein structures in cellularlamella at pseudo-atomic resolution by GisSPA）[1]。

该论文的通讯作者是中科院生物物理研究所章新政研究员和北京理工大学医学技术学院万晓华副教授，第一作者是程静（章新政组博士后）和刘童（张法和万晓华组研究生）。

（来源：课题组）

章新政说：“传统的电子断层重构技术，需要旋转样品台，过程非常麻烦。原本只需要拍一张照片，由于旋转样品台的介入，需要在不同的角度采集照片。最后可能一共需要采集 60 张照片，单颗粒方法一天采集的数据量断层方法需要 30-40 天，数据采集的效率很低。”而这项研究摈弃了电子断层重构，可以直接在单张照片中定位蛋白质，然后在此基础上进行重构，这样只需要 1 天就能完成工作。

简单来说，低温电子断层扫描是用于原位研究蛋白质复合物结构的一个主要工具。然而，倾转系列图像数据收集的通量仍然相当低。课题组出成员设计了 isSPA，并在这项工作中与北理工的张法和万晓华合作，进行了 GPU 加速优化，可以在细胞切片中定位目标蛋白复合物，并在近原子分辨率下重建蛋白复合物。

由于不需要采集倾转系列图像和断层重构，GisSPA 可以实现高通量的数据收集，这对于低丰度的蛋白质复合物至关重要。

该研究分别解析了细胞层中的红藻的藻胆体和光系统 II 复合体结构，分辨率分别达到了 3.4 埃和 3.9 埃。研究表明，他们所发展的 GisSPA 技术有助于直接在细胞内进行高分辨率蛋白质结构测定。

图丨GPU 加速和优化 (来源：Nature Communications)

研究者们得到了一个 3.9 埃分辨率的光系统 II（photosystem II, PSII）复合物的重建。此前，有研究人员报告了在二维投影匹配中发生的模型偏差效应，肺炎双球菌细胞中的核糖体的分辨率偏高。而运用 GisSPA 程序进行解析，可以得到更加准确、合理的结果，且通过对比发现 GisSPA 解析的 70S 整体结构是无模型偏差的。

该研究进一步提到，假阳性探测颗粒会在探测函数所使用的频率范围内产生模型偏差效应，这个效应会降低重构的分辨率，因此去除假阳性探测对于高分辨率的结构测定是必要的。由于在高于 1/8Å-1 的频率上信噪比相对较低，而且排序方法需要不包括在粒子定位中的信号。因此，频率高于 1/8Å-1 的信号一般不建议用于二维投影匹配计算。

图丨通过 GisSPA 解析红藻的 PSII 复合物和肺炎支原体的核糖体 (来源：Nature Communications)

GisSPA 的探测效率主要受到目标蛋白在分子量和样品厚度的影响。因此，要拓宽 GisSPA 的应用范围，还需要优化细胞切片样品制备方法。

GisSPA 在原位结构体系非常有效，且分子量越大，效果更好。对于未来的研究计划，章新政表示，一方面，希望能够实现更小分子量分子的原位结构解析；另一方面，将通过提高细胞切片的质量使数据采集的效果更好。

参考资料：

1.Cheng, J., Liu, T., You, X. et al. Determining protein structures in cellular lamella at pseudo-atomic resolution by GisSPA. Nature Communications 14, 1282 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36175-y.