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前言

微好氧和趋化性的固氮菌——亚沃螺菌（Azospirillum）与某些谷物（如硬质小麦和玉米）密切共生，并在富集这些生态位的大量营养元素氮（以氨的形式）方面发挥活跃作用，亚沃螺菌属被认为具有高度多态性，它们在液体环境中使用单个极性鞭毛进行高度运动，而在黏稠环境中则使用周围分布的鞭毛。

亚沃螺菌能够以生物膜的形式附着在表面上，或者以非增殖的菌群形式细胞间聚集，这两个过程被认为对细菌在土壤中的生存和扩散有积极影响。尽管通过细菌胞外多糖的存在来表征了生物膜形成和絮凝作用，但观察到的胞外多糖的性质以及促进其组织的潜在分子机制。

菌株和生长条件

土壤是一个异质而复杂的生态系统，为微生物提供了多种生境，包括土壤孔隙、土壤团聚体和根际，即植物根系周围的土壤区域。

土壤细菌、如根瘤菌和氮固定杆菌都受到环境条件的季节性显著波动，可以通过长期附着在特定寄主植物的根系上存活，这种共生关系依赖于趋化性。

在这些所谓的根际细菌中，螺旋杆菌属（α-变形菌门）的物种现在得到了广泛的研究，这可能是因为它们在农业中作为生物肥料具有商业和工业应用。

微好氧固氮菌亚沃螺菌与某些谷物（如硬质小麦和玉米）共生，并在富集这些生态位的大量营养元素氮中发挥活跃作用。

一些寄主植物中也观察到了植物生长和作物产量的增加，这些有益特性可能与产生某些植物生长调节物质（如生长素、细胞分裂素和赤霉素）有关，这些物质促进了这些过程的进行。

比如在接种了亚沃螺菌的情况下，多项研究观察到了根系形态的改变，包括侧根数量的增加和根毛的增长，从而扩大了可用于吸收水分和利用矿物质的根部表面积。

而定殖的细菌很可能通过根系分泌物获得营养，并在相对受保护的生境中牢固附着，防止细菌通过水分散入周围养分贫瘠的土壤中。

事后看来，只有当细菌能够在土壤中存活并通过吸附在寄主根系上积累大量细菌群体时，亚沃螺菌-植物根共生才会成功进行。

在根际区，通过根系分泌物和根际物质沉积产生了从根部到周围土壤的营养梯度下降，而趋化作用被认为促进了向植物根部的迁移，细菌可以从中获取所需的碳和氮源，如氨基酸、糖类和有机酸。

已经证明携带一种未知遗传突变的亚沃螺菌(Azospirillum brasilense)趋化突变株在根表面定殖方面存在障碍，这表明趋化作用对于亚沃螺菌在寄主植物根际的建立是至关重要的。

趋化作用允许细菌使用细胞膜上的受体和专门的信号传导途径“感知”其环境中的时间依赖的物理化学参数，通过改变游动方向或速度来响应刺激强度的变化。

更具体地说，趋化作用使得有运动能力的细菌能够朝着有利的化学条件移动，并避开有害条件，通过调节一组专门的趋化蛋白活性来改变鞭毛旋转的方向。

小麦根粘附试验

brasilense菌株在TY液体培养基中过夜培养（28°C，摇床培养），直至进入平稳生长期（1.0 - 1.8 A，O.D. 600nm）。

过夜培养物使用磷酸盐缓冲液（每升：1.7克K2HPO4和1.36克KH2PO4）进行标准化，使其光密度达到1.0，标准化的细菌培养物在室温下孵育1小时，然后取200微升的每个菌株接种到含有0.5克无菌一周大的小麦（Triticum aestivum）根的玻璃管中，加入9.8毫升磷酸盐缓冲液。接种物在室温下震荡孵育2小时。

细菌细胞经过3次用缓冲液震荡洗涤后，在研钵中加入5毫升新鲜缓冲液进行匀浆，使用100微升的匀浆液进行10的6次稀释。

每个稀释液中取10微升，三个孔位点接种到含有碳源但缺乏氮源的固体最小培养基（MMAB）平板上，如前文所述。在5天后计算菌落形成单位（CFUs）。

对标准化细菌细胞进行蛋白酶K消化，最终体积为2毫克/毫升，于室温下消化1小时，同时加入10毫克/毫升的四环素（Tet10）以阻止进一步的蛋白质合成。

然后洗涤细菌细胞以去除酶和抗生素，并将其悬浮在磷酸盐缓冲液中。取200微升的每个消化的菌株用于接种发芽的小麦种子，处理方法同上，同时将细菌细胞仅用Tet10进行处理作为对照。

生物膜分析

Azospirillum brasilense菌株在tryptone-yeast培养基中培养至静止期，并使用磷酸盐缓冲液将其标准化至光密度值（OD600nm）为1.0 A。

细胞被重新接种到装有3毫升TY液体或MMAB（每升：3克K2HPO4，1克NaH2PO4，0.15克KCl，微量Na2MoO4；高压灭菌后，加入5毫升60克/L MgSO4 2-，500微升20克/L CaCl2，和250微升FeSO4 [每50毫升，0.631克FeSO4和0.592 EDTA)]的液体培养基中，该培养基中含有氮源（1毫摩尔或10毫摩尔NaNO3或1毫摩尔NH4Cl或10毫摩尔NH4Cl或无氮源，具体根据实验要求），以及5毫摩尔果糖和5毫摩尔苹果酸作为碳源。

细胞在28°C条件下，以摇床（110转/分钟）培养1天和/或7天，培养结束后，测量每个孔的OD600nm，并使用无菌水去除松散粘附的细胞碎片，随后向所有进行测定的孔中加入结晶紫染料。

染料在室温下孵育30分钟，然后用无菌水冲洗板子以去除非结合的染料，向每个孔中加入70%乙醇，在摇床上以相同条件孵育1小时溶解染料，测量OD600nm值，并使用以下公式计算细胞粘附百分比：[(染色细胞的OD值) ÷ (孔内培养物的OD值) × (染色细胞的OD值) × (100)]。

brasilense菌株Sp7（受体菌株）通过与携带自杀质粒pRL27的E. coli菌株EA145（供体菌株）进行双亲共轭，插入转座子，具体操作方法基本上与之前的描述相同。

供体和受体菌株被培养至中指数期（OD600nm ≡ 0.6），混合并通过0.45微米的分析滤膜（Fisher，目录号）进行过滤收集。

prL27质粒以1：3的比例与Sp7菌株混合共培养（供体菌100毫升：受体菌300毫升），收集细胞的滤膜在28°C的TY琼脂培养基上孵育过夜。

孵育后，细胞在含抗生素和5毫摩尔苹果酸的MMAB液体培养基中重新悬浮；氮源和DAP被省略，以排除E. coli供体菌株的选择，因为E. coli供体菌株除了是DAP辅助生长的菌株外，还不能固定大气中的氮气。

富集和筛选突变体

通过筛选与野生型菌株Sp7相比具有更多或更少聚团现象的菌落，分离了Azospirillum brasilense突变体，并通过PCR使用内向引物和转座子特异性tpnRL 13-in和tpnRL 17-in引物对每个突变体中的转座子进行了确认。

通过使用Sp7作为对照，进行了聚团实验以确认每个突变体的表型，通过菌落与刚果红的结合能力，定性评估了潜在突变体的EPS产生能力。

将潜在突变体与野生型菌株在TY琼脂和MMAB琼脂上重新划线，观察菌落形态上的差异，在将标准化的突变体细胞培养物接种到TY半固体培养基（每升：10克酪蛋白胨、5克酵母提取物和3克琼脂）中后，观察在28℃孵育24小时后的环直径来测试运动性的差异。

将刚果红加入到TY琼脂和MMAB + 8毫摩尔果糖 + 0.5毫摩尔NaNO3琼脂中，最终浓度为40毫克/毫升，以测试表面糖与刚果红的结合情况。

在这里，通过利用携带在pRL27载体上的ori6K复制起始点，在表达pir蛋白的大肠杆菌株中进行转化后，利用救援克隆的方法完成了转座子插入的克隆，转位基因组DNA经BamHI或EcoRI消化，这两种酶不在转座子序列的范围内切割，用T4 DNA连接酶进行自连接，并转化到PIR1细胞中。

转座子周围的DNA序列上的转座子连接位点通过测序反应获得，并且在选择的转化体中使用外向定向和转座子特异引物tnpnRL17-Out和tnp13-Out进行测序，这些引物分别与转座子序列的oriR6K和Kmr末端结合。

每个序列中的转座子末端被鉴定以确定转座子插入位点，转座子周围的DNA序列被翻译并与蛋白质序列数据库（GenBank）进行比对，使用Blast X算法。

在低曝气条件下巴西氮螺旋菌在固定相优先结合

接种后，Azospirillum细菌会吸附在根系上并在其表面繁殖，这些细菌还能够絮凝。

絮凝和小麦根系黏附是否是类似的过程和/或代表“生物膜”形成能力的表现仍不清楚，以确定Azospirillum brasilense中的最佳生物膜形成情况。

选择野生型菌株Sp7，观察其在玻璃和聚氯乙烯（PVLC）上在补充了5 mM果糖、5 mM苹果酸和18 mM NH4Cl的最小培养基和复杂培养基中的黏附情况。

当最初在TY培养至平衡生长期后，野生型菌株在随后接种到含有最小培养基的孔中时，在24小时内在PVLC上形成了更广泛的生物膜，而且这种效应在低曝气条件下最为显著（p = 8.8 x 10-4）。

相反，当Sp7在TY培养至指数生长期后，随后在低曝气的MMAB中再次接种，黏附显著减少（p = 0.001），表明细菌在表面黏附中存在生长阶段偏好。有趣的是，在细菌首先在MMAB中培养然后随后移植到含有MMAB或TY的孔中的情况下，PVLC上的黏附均为零。

在高曝气和低曝气条件下，培养在TY中然后再次接种到含有TY的孔中的细菌也无法黏附（未显示数据）。

结论

这个实验在对根际细菌Azospirillum brasilense的两个现象进行表征：生物膜形成（一种细胞对表面的黏附形式）和絮凝（一种细胞对细胞的相互作用和应激响应）。

虽然已经证明这两个过程都涉及细菌胞外多糖的组织，但观察到的胞外多糖的性质仍然不清楚，以及促进它们组织的潜在分子机制也不清楚。

我们培养在TY培养基中的细胞对浸泡在微量培养基中的PVLC的黏附偏好也可能表明一种应激响应，在其他接种模式中没有观察到，从富营养环境向营养限制环境的转变导致生理变化，促使从游离生活方式转变为固着生活方式。

从先验的角度来看，这一观察结果表明Azospirillum brasilense的生物膜形成可能是在营养匮乏条件下的一种可能的生存机制，表面定殖提供了许多优势，如增加营养物的捕获。

实际上，在其他革兰氏阴性微生物中也存在这种趋势，当假单胞菌荧光素菌首先在LB培养基中培养，然后再次接种时，不可逆的与石英砂的黏附增加。

在甜菜根瘤菌中观察到了生物膜形成的增加，响应是在静止的微量培养基中接种，大肠杆菌O517：H7和黄杆菌也观察到只有在营养匮乏条件下才会附着在表面上。

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