《AM》：多组学分析蚕丝蛋白差异增强干细胞的旁分泌和再生功能

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蚕丝的两种主要蛋白质丝纤维蛋白（SF）和丝蛋白（SS）是组织工程和再生医学具有巨大潜力的生物材料。然而，它们与干细胞的生化相互作用仍不清楚。东南大学张薇教授团队通过采用多组学方法获得SF和SS触发的间充质干细胞（MSCs）的细胞过程和通路的全局视角，在高通量分子水平上深入识别细胞-生物材料的相互作用。综合RNA测序和蛋白质组学分析证实，SF和SS启动广泛但不同的细胞反应，并增强MSCs的旁分泌功能，这些功能通过差异激活整合素/PI3K/Akt和糖酵解信号通路来调节细胞外基质沉积、血管生成和免疫调节。SF和SS刺激的MSCs的这些旁分泌信号，通过调节皮肤伤口微环境中多个驻留细胞（成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞）的行为，有效地促进皮肤再生。与SS相比，SF在体内外均表现出更好的免疫调节作用，表明其作为MSCs载体材料的皮肤再生材料的潜力更大。本研究为细胞与SF和SS的相互作用提供了全面和可靠的见解，使基于蚕丝的组织工程和干细胞治疗的治疗方法的未来发展成为可能。

相关研究内容以“Silk Fibroin and Sericin Differentially Potentiate the Paracrine and Regenerative Functions of Stem Cells Through Multiomics Analysis”为题于2023年3月13日发表在《Advanced Materials》上。

图1 SF和SS在体外调节MSCs的细胞行为

本研究从家蚕的生丝纤维中提取SF和SS，提取过程示意图如图1A所示。在≈为5%（w/v）浓度下提取的SF和SS呈黄色且相对清晰。SS（3277.43cm−1）比SF（3275.02cm−1）具有更宽的酰胺a带，说明SS的结构更随机，SF的结晶度更高（图1B），也反映了它们在天然丝纤维中的独特功能。总之，这些结果表明，在本研究中成功地制备了SF和SS。在不同浓度的SF或SS条件下培养1、3和7天后，MSCs可正常增殖(图1C、D）。与未处理的Ctrl相比，SF和SS在第1天显著提高了MSCs的活力，表明SF和SS在提高细胞活力方面的积极作用（图1E）。采用alamar blue法评价SF和SS对MSCs代谢（线粒体）活性的影响，三组间无显著性差异（图1F）。随后进行F-actin染色来研究SF和SS对间SC干细胞形态的影响。结果显示，Ctrl组、SF组和SS组的MSCs表现出相似的纺锤形形态（图1G）。使用划痕实验进一步研究了SF和SS处理后MSCs的迁移情况。结果显示，MSCs对SF或SS的迁移能力并没有显著改善（图1H）。三组间ALP活性、脂滴形成或软骨糖胺聚糖生成均无显著差异（图1I-K），提示SF和SS处理不能有效指导MSC分化。因此，SF和SS可能影响MSCs的其他细胞功能（如旁分泌信号），有待进一步探索。

图2 RNA-seq揭示了由SF和SS触发的MSCs广泛的转录组变化

在含/不含0.2%（w/v）SF或SS的间充质干细胞培养3天后，进行RNA-seq研究间充质干细胞在转录水平上的广泛变化（图2A）。对Ctrl、SF和SS组的三个独立重复进行测序，并通过计算每千碱基每百万reads转录本的片段（FPKM）对基因表达水平进行归一化。各组的重复均表现出较高的一致性（图2B）。作者在Ctrl组、SF组和SS组之间进行了两两比较，以确定SF组或SS处理后的MSCs中的差异表达基因（DEGs）（图2C-F）。配对比较中的重叠显示，只有120个是相同的，而>1000个是在SF（1111）、SS和Ctrl（1062）、SF和SS（1160）中发生了变化，证实了SF和SS对MSCs的稳健而明显的影响（图2G）。SF和SS不能显著促进成骨分化（RUNX2、BGLAP、SPP1和ALPL）、成脂分化（PPARG、CEBPA、CEBPB和ZNF423）、软骨分化（SOX9、ACAN、COMP和COL11A1）和干细胞维持（POU5F1和KLF4）（图2H）。从人类蛋白图谱中获得了3971个编码分泌蛋白的基因，其中397个在三组之间有差异表达，表明SF和SS对MSCs的分泌组有很强的影响（图2I）。Ctrl、SF和SS之间的显著差异与生长因子、炎症因子、ECM和基质蛋白酶相关（图2J-M），它们参与了组织修复和再生的各种生物过程的调节，包括细胞招募、干细胞/祖细胞分化、血管生成、免疫调节和组织重塑。

图3 由SF和SS引发的MSCs变化的功能见解

BP的前GO项显著富集于上调的DEGs（SF vs Ctrl）（图3A）。REVIGO分析将所有BP的GO术语划分为更广泛的类别（SF vs Ctrl）（图3B）。如图3C所示，与ECM组织和血管生成相关的显著GO术语（SF vs Ctrl）。在使用RNA-seq的MSCs转录谱中，SF组与Ctrl组相比，各种胶原的表达显著升高，随后通过qPCR进行验证（图3D、E）。采用Picrosirius染色来验证胶原蛋白在蛋白水平上的变化（图3F）。RNA-seq结果显示，与Ctrl组相比，SF组的关键血管生成因子VEGFA和IGF1表达上调，随后通过qPCR验证（图3G）。与Ctrl组相比，SF组的VEGFA和IGF1的产量显著升高（图3H）。MSCs在SF刺激后可能被激活的多个信号通路，包括PI3K/Akt、ecm受体相互作用、病灶黏附、缺氧诱导因子-1（HIF-1）、TGF-β和amp活化蛋白激酶（AMPK）信号通路（图3I）。SF显著促进了各种整合素的基因表达，在ITGA1、ITGA6、ITGAV和ITGB1中也有相似的上调趋势（图3J）。Western blot结果显示，SF组的相对p-Akt/Akt比值显著高于Ctrl组（图3K），表明SF处理后，MSCs中PI3K/Akt信号通路被激活。在MSCs中，LY294002抑制PI3K/Akt信号的抑制比RGD肽抑制整合素信号的抑制更强（图3L、M）。BP的GO术语在典型糖酵解、肽基酪氨酸磷酸化的正调控、对缺氧的反应、血管生成和细胞粘附中富集（图3O）。与这三个类别相关的个别GO术语如图3P所示。KEGG富集分析显示，与Ctrl组相比，SS处理的MSCs的糖酵解/糖异生和HIF-1信号通路上调（图3Q）。与Ctrl组相比，许多糖酵解相关基因在SS组中显著上调（图3R）。qPCR结果与RNA-seq观察到的变化一致（图3S）。RNA-seq和qPCR结果显示，与Ctrl组相比，SS组的血管生成基因VEGFA和NGF的表达显著上调（图3T）。ELISA显示，SS组的VEGFA和NGF的分泌水平显著高于Ctrl组（图3U）。

图4 蛋白质组学揭示了由SF和SS引起的细胞分泌组变化

采用蛋白质组学分析，研究用/不加SF或SS处理3天的MSCs的分泌组变化，如图4A所示。主成分分析（PCA）细胞分泌组的蛋白质组数据显示，每组的复制被组装成一个清晰的簇，并显示出相似的特征（图4B）。Venn图显示，三组间MSCs具有高度相似的分泌组，说明SF和SS主要诱导细胞分泌组水平的变化，而不是类型（图4C）。在SF和Ctrl中鉴定了47个差异表达蛋白（DEPs），其中35个表达上调，12个表达下调（图4D）。SS与Ctrl相比，有10个蛋白显著上调，而48个蛋白显著下调（图4E）。当SF组与SS组相比，有46个DEPs表达上调，11个DEPs表达下调（图4F）。作者进行了GO和KEGG富集分析，以获得对这些分泌组变化的功能洞察力（图4G-J）。蛋白的表达和分泌发生了显著变化，SF组的胶原蛋白和生长因子的分泌显著高于Ctrl或SS组（图4K）。这些结果表明由SF或SS启动的MSCs的分泌组在调节伤口愈合，特别是皮肤修复和再生方面显示出巨大的潜力。

图5 SF和SS刺激的MSCs旁分泌信号调节伤口愈合的驻留细胞行为

为了探究其旁分泌产物的影响，作者收集了经/不经SF或SS处理的MSCs的CMs，并应用于成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的培养，如图5A所示。CCK-8实验显示，与Ctrl CM相比，用SF CM和SS CM同时处理的成纤维细胞在第1天和第3天的增殖率增加，这表明SF或SS诱导的MSCs的这些旁分泌信号在促进成纤维细胞增殖中发挥了积极作用（图5B）。与Ctrl CM相比，SS CM在第1天略微增加了成纤维细胞的细胞活力（图5C）。与Ctrl CM和SF CM相比，SS CM显著促进了成纤维细胞的迁移，而SF CM对成纤维细胞没有明显的促迁移作用（图5D）。从暴露于SF或SS的MSCs中收集的CM对HUVECs的活力没有显著影响（图5F）。培养24或36 h后，只有SS CM增强了HUVECs的迁移，而SF CM的影响最小（图5G）。与Ctrl和SS组相比，SF CM在管长度和节点数量方面有显著改善，而SS CM与Ctrl组相比增加了管的数量（图5H）。与Ctrl CM相比，SS CM同时轻度促进了促炎因子（IL-1β）和抗炎因子（IL-10）的产生（图5I）。SF CM组巨噬细胞中iNOS的表达显著降低，而CD206和ARG-1的表达增加（图5J、K）。

图6 MSC-SF/SS相互作用的3D水凝胶体系的制备与评价

如图6A、B所示，成功制备了含/不含0.2%（w/v）SF或SS的msc种子光交联GelMA水凝胶，称为GelMA、SF-GelMA和SS-GelMA。在掺入SF或SS后，GelMA水凝胶的表面形貌、孔径和孔隙率没有明显改变（图6C、D、E）。如图6F所示，SF和SS均没有改变GelMA水凝胶的存储模量（G’），而SS仅略有提高了其损失模量（G″），说明SS温和地提高了水凝胶的粘度，而SF和SS对水凝胶的弹性没有影响。采用活/死染色评价3D水凝胶包裹的MSCs的活力，结果显示各组MSCs的细胞活力较高，>为92%，三组间无显著差异（图6G）。与其他组或培养期相比，用0.2%（w/v）SF处理3天的MSCs显示出最高水平的细胞代谢物（图6H）。与3D水凝胶中的Ctrl和SS相比，SF也显著提高了MSCs的胶原生成（图6I）。与GelMA相比，SF-GelMA和SS-GelMA的IGF1和VEGFA的分泌分别显著增加（图6J，K），当MSCs在SS-GelMA中培养时，SS显著提高了乳酸的产生（图6M），表明在2D和3D培养中，SS处理后，MSCs的糖酵解均增强。

图7 SF和SS触发的MSCs旁分泌信号促进体内皮肤修复和再生

图7A为动物研究程序的示意图。每个伤口采用MSCs种子GelMA水凝胶加/不加SF或SS。与GelMA相比，SF-GelMA和SS-GelMA在第7天和第10天均表现出加速伤口愈合的能力（图7B、C）。使用H&E）和MT染色进行组织学评估，以评估第14天修复组织的形成和成熟情况（图7D、E）。皮肤厚度定量分析显示，SF-GelMA和SS-GelMA组均较GelMA组显著增加（图7F）。SF和SS增强了新形成的皮肤组织的血管生成，其新血管的数量和横截面积明显高于GelMA组（图7G、H）。在SF-GelMA和SS-GelMA中观察到的毛囊数量高于GelMA（图7I）。SF-GelMA和SS-GelMA组的COL1染色均略强于GelMA（图7J）。对血管内皮细胞标记物CD31的染色显示，与GelMA组相比，SF-GelMA和SS-GelMA组形成了更多的新血管（图7K）。IL-1β和CD206的染色以及定量分析显示，与GelMA组相比，SF-GelMA组IL-1β的染色强度显著降低，CD206的染色强度增加（图7L-O）。

在本研究中，作者应用多组学方法全面阐明了SF和SS与MSCs的生化相互作用，以及随后BPs和分子活性的变化。对转录的整合RNA测序和蛋白质组学分析细胞图谱和细胞分泌组一致表明，SF和SS启动了广泛但不同的细胞反应，并增强了MSCs的旁分泌功能，通过不同的激活整合素/PI3K/Akt和糖酵解信号通路来调节ECM沉积、血管生成和免疫调节。由SF和SS刺激的MSCs的这些旁分泌信号通过影响皮肤伤口微环境中多个驻留细胞的行为，有效地改善了皮肤的修复和再生。与SS相比，SF在体内外均表现出更好的免疫调节作用，表明其作为MSCs载体材料的皮肤再生材料的潜力更大。这是第一个通过多组学分析为细胞与SF和SS的相互作用提供全球和可靠的见解的研究，这直接有助于设计组织工程和干细胞治疗的丝基支架。此外，本研究结果强调了“组学”技术在深入、高通量分子水平上评估细胞-生物材料相互作用的重要性和可行性，这可能对组织工程支架在材料选择和支架设计方面的未来发展具有广泛的意义。

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