结核分枝杆菌PtpA诱导宿主细胞铁死亡促进病原菌播散

作者：强丽华，张勇，雷泽慧，陆喆，谭莎莎，葛浦浦，柴琪瑶，赵梦圆，张馨文，李冰曦，逄宇，张令强，刘翠华，汪静

第一作者及单位：强丽华，中国科学院微生物研究所/中国科学院大学存济医学院；张勇，中国科学院微生物研究所；雷泽慧，中国科学院微生物研究所/中国科学院大学存济医学院

通信作者及单位：汪静，中国科学院微生物研究所；刘翠华，中国科学院微生物研究所/中国科学院大学存济医学院；张令强，北京生命科学研究所/国家蛋白质科学中心

A mycobacterial effector promotes ferroptosis-dependent pathogenicity and dissemination

Nature Communications, 2023. Online ahead of print.

doi: 10.1038/s41467-023-37148-x

研究背景

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一类重大慢性传染病。据世界卫生组织报道，2021年全球有近1060万新发TB患者，约有160万人死于MTB感染。MTB感染会诱导宿主细胞发生多种死亡形式，其中铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁离子，由脂质过氧化物修复系统紊乱驱动的细胞程序性死亡形式。近年来，越来越多的证据表明，诱导宿主细胞铁死亡是多种病原体实现其致病性和播散的重要方式。MTB诱导的宿主细胞死亡表现出谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）水平降低以及游离铁、线粒体超氧化物和脂质过氧化作用增加等铁死亡表型，但有关何种MTB效应蛋白参与此过程及其中的调控机制尚不清晰。因此，鉴定MTB调控宿主细胞铁死亡的关键效应蛋白并阐明其作用机制有望为靶向抑制病原体致病性及播散的TB治疗提供理论基础和潜在靶点。

研究方法

1. 筛选体系构建：构建过表达结核分枝杆菌磷酸酶和激酶的A549细胞，并使用铁死亡诱导剂RSL3对其进行处理。通过细胞活力检测试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）检测细胞的存活情况，以此从结核分枝杆菌磷酸酶和激酶中筛选促进宿主细胞铁死亡的关键效应蛋白。

2. 机制探究：运用转录组测序技术和一系列遗传学（基因敲除）、细胞生物学（细胞感染）和生物化学技术（蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光等），验证MTB分泌的磷酸酶PtpA诱导宿主铁死亡的作用，并探究其调控宿主铁死亡信号通路的分子机制，以及对MTB致病性和播散的影响。

3. 小鼠水平验证：通过MTB PtpA及其各种突变菌株的雾化感染，建立小鼠结核感染模型，感染后的部分小鼠腹腔给予铁死亡抑制剂Lip-1治疗。通过HE染色、抗酸染色、细菌载量计数等方法观察小鼠肺组织的病理情况及细菌存活情况；通过免疫组化染色、免疫荧光染色等方法检测小鼠肺组织H3R2me2a修饰和GPX4表达，以及组织坏死情况。

研究结果

1. MTB PtpA诱导GPX4依赖的铁死亡：在13种MTB磷酸酶和激酶中，研究人员发现磷酸酶PtpA是一种诱导宿主细胞铁死亡的重要效应蛋白。为了验证PtpA在MTB感染期间对铁死亡的调节作用，研究人员构建ptpA基因缺失的MTB菌株（MTB ΔptpA）以及在此基础上回补ptpA基因的菌株（MTB ΔptpA:ptpA）。通过CCK-8和C11-BODIPY流式实验证实，相较于感染WT MTB和MTB ΔptpA:ptpA的细胞，感染MTB ΔptpA的细胞存活率更高，脂质过氧化物积累水平也明显下降。此外，铁死亡抑制剂Fer-1和Lip-1可以抑制PtpA引起的细胞死亡和脂质过氧化物水平的升高。因此，这些结果表明MTB PtpA是MTB感染期间关键的促铁死亡效应蛋白。随后，研究人员针对PtpA调控铁死亡的分子机制进行深入研究。结合转录组测序（RNA-seq）和免疫印迹实验发现PtpA在MTB感染期间抑制铁死亡关键调控蛋白GPX4的转录和表达，并且重塑GPX4的表达可以抑制细胞死亡并降低脂质过氧化物水平。综上，MTB PtpA诱导宿主细胞中GPX4介导的铁死亡的发生。具体见图1。

图1 MTB PtpA诱导GPX4依赖的铁死亡。a: U937和稳定表达PtpA的U937细胞（PtpA-U937）的存活情况。b: U937和PtpA-U937细胞死亡的动态示意图。标尺，25 μm。c: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞的存活情况。标尺，25 μm。d: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞中碘化丙啶（PI）阳性细胞的比例。e: 流式细胞术分析MTB及MTB突变体菌株感染的细胞内脂质过氧化物的水平。f: MTB及MTB突变体菌株感染的细胞中脂质过氧化细胞的比例。g: GSH代谢有关基因的热图。h: U937细胞中GPX4、α-Tubulin和PtpA表达水平的检测。i: 感染MTB及MTB突菌株的U937细胞在vehicle、DOX或Fer-1处理下的存活情况。j: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞在vehicle、DOX或Fer-1处理下脂质过氧化细胞的比例。

2. MTB PtpA通过非典型的RanGDP结合位点进入宿主细胞核诱导铁死亡：在MTB感染过程中，MTB PtpA同时定位于宿主细胞的细胞质和细胞核中。研究人员通过体外入核实验证实PtpA通过RaDAR入核途径中的RanGDP/NTF2组成的复合物进入宿主细胞核。随后，研究人员进一步探究PtpA进入细胞核的关键位点。经过多序列比对分析和定点突变实验，发现第11位半胱氨酸（Cys）突变为丙氨酸（Ala）的PtpA突变体（PtpAC11A）失去进入宿主细胞核及与RanGDP互作的能力。此外，感染回补ptpAC11A菌株（MTB ΔptpA:ptpAC11A）的细胞死亡率比感染MTB ΔptpA:ptpA的细胞低。这些结果表明，PtpA通过其RanGDP结合位点Cys11进入宿主细胞核，进而诱导宿主细胞铁死亡发生。具体见图2。

图2 MTB PtpA通过非典型的RanGDP结合位点进入宿主细胞核诱导铁死亡。a: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞中PtpA、α-Tubulin和PARP的分布情况。b: 体外入核实验检测蛋白的定位情况。标尺，25 μm。c: PtpA和Ran、NTF2的相互作用。d: PtpA及其突变体在细胞内的定位情况。标尺，7.5 μm。e: PtpA或PtpA突变体定位于细胞核内的细胞比例。f: PtpA及PtpAC11A和Ran的相互作用。g: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞在vehicle或Fer-1处理下PI阳性细胞的比例。h: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞在vehicle或Fer-1处理下的存活情况。标尺，25 μm。

3. 细胞核内的PtpA通过靶向精氨酸甲基转移酶PRMT6促进铁死亡：为了进一步探究PtpA在细胞核内调控铁死亡的分子机制。研究人员通过酵母双杂交实验鉴定到细胞核内精氨酸甲基转移酶PRMT6和PtpA存在相互作用。免疫荧光实验也证实PRMT6和PtpA在细胞核内存在共定位。随后，研究人员进一步检测PRMT6对铁死亡的调控作用，发现PRMT6基因缺失（PRMT6-/-）的细胞可以抵抗RSL3诱导的铁死亡，并且释放的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和脂质过氧化物积累水平也显著降低。与PRMT6+/+ U937细胞，PRMT6-/- U937细胞分别感染WT MTB、MTB ΔptpA:ptpA和MTB ΔptpA:ptpA菌株后，各组别间的细胞死亡、LDH释放量和脂质过氧化累积的差异明显减小。因此，MTB PtpA通过靶向精氨酸甲基转移酶PRMT6促进宿主细胞铁死亡。具体见图3。

图3 细胞核内的PtpA通过靶向PRMT6促进铁死亡。a: PtpA和PRMT6的相互作用。b: PtpA和PRMT6的共定位情况。标尺，8 μm。c: GFP、GFP-PtpA分别和Flag-PRMT6在细胞核内共定位的细胞比例。d: PRMT6+/+ 和PRMT6-/- U937细胞中PRMT6、H3R2me2a、GAPDH和H3的表达情况。e: PRMT6+/+和PRMT6-/- U937 细胞的死亡情况。f: PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中PI阳性的细胞比例。g: 流式细胞术分析PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中脂质过氧化物的水平。h：PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中脂质过氧化细胞的比例。i: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中PI阳性的细胞比例。j: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中LDH的释放情况。k: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中脂质过氧化细胞的比例。

4. MTB PtpA通过促进PRMT6介导的H3R2me2a修饰抑制GPX4的表达：PRMT6作为一种组蛋白甲基转移酶，主要负责催化H3R2me2a的修饰。为了探究PtpA对PRMT6甲基转移酶活性的影响，研究人员通过免疫印迹检测MTB感染过程中H3R2me2a的变化。相较于感染WT MTB和MTB ΔptpA:ptpA的细胞，感染MTB ΔptpA的细胞中H3R2me2a修饰水平显著下降。此外，过表达PRMT6酶活突变体（PRMT6KLA）的细胞存活率更高，脂质过氧化物积累水平也更少。以上结果表明，MTB PtpA通过促进PRMT6介导的H3R2me2a修饰来调控宿主细胞铁死亡。后续的感染实验也证实在PRMT6甲基转移酶活性抑制剂EPZ020411存在的情况下，PtpA失去了诱导宿主细胞铁死亡的能力。H3R2me2a在细胞中的功能主要是抑制基因的转录，QRT-PCR和染色体免疫共沉淀实验表明H3R2me2a在GPX4基因启动子中富集，进而抑制GPX4的转录。此外，感染WT MTB或MTB ΔptpA:ptpA的细胞中GPX4基因启动子上的H3R2me2a富集比例明显多于感染MTB ΔptpA细胞。综上所述，PtpA通过促进PRMT6介导的H3R2me2a来抑制GPX4的转录。具体见图4。

图4 MTB PtpA通过促进PRMT6介导的H3R2me2a修饰抑制GPX4的表达。a: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞中PRMT6、H3R2me2a、GAPDH和H3的表达情况。b: PtpA和PRMT6、PRMT6KLA的相互作用。c: 过表达PRMT6和PRMT6KLA的 A549细胞中PI阳性的细胞比例。d: 免疫荧光分析过表达PRMT6和PRMT6KLA的 A549细胞中脂质过氧化物的水平。标尺，10 μm。e: 过表达PRMT6和PRMT6KLA的 A549细胞中非脂质过氧化细胞的比例。f: 过表达PRMT6和PRMT6KLA的 A549细胞中脂质过氧化细胞的比例。g: EPZ020411处理后PI阳性的细胞比例。h：EPZ020411处理后脂质过氧化细胞的比例。i: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中GPX4的转录情况。j: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中PRMT6、GPX4、H3R2me2a、GAPDH和H3的表达情况。K: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中H3R2me2a在GPX4启动子的富集情况。

5. MTB PtpA增强PRMT6的甲基转移酶活性：为了进一步探索PtpA调控PRMT6甲基转移酶活性的分子机制，研究人员构建了PtpA截短体，其中PtpA的N端区域（氨基酸:1–50）与PRMT6相互作用，C端区域（氨基酸:122–163）与组蛋白H3相互作用。以上结果表明，PtpA不仅直接增强PRMT6的甲基转移酶活性，还增强PRMT6与组蛋白H3的亲和力，从而导致H3R2me2a修饰的增加。细胞感染实验也表明，感染回补缺失1-50氨基酸的PtpA突变体（MTB ΔptpA:ptpAΔ1-50）的细胞中H3R2me2a水平低于感染MTB ΔptpA:ptpA的细胞。此外，与感染MTB ΔptpA:ptpA的细胞相比，感染MTB ΔptpA:ptpAΔ1-50的细胞死亡率、LDH释放和脂质过氧化累积水平都显著下降。这些结果表明，PtpA不仅直接增强PRMT6的甲基转移酶活性，还增强了PRMT6与组蛋白H3的亲和力，从而促进H3R2me2a的甲基化修饰。具体见图5。

图5 MTB PtpA增强PRMT6的甲基转移酶活性。a: 不同PtpA浓度处理下，PRMT6、H3R2me2a、GAPDH和H3的变化情况。b: PtpA截短体示意图。c: PtpA及PtpA截短体和PRMT6的相互作用。d: 感染MTB及MTB突变菌株的U937细胞中PRMT6、H3R2me2a、GAPDH和H3的表达情况。e: 过表达PtpA及其截短体的A549细胞中PI阳性的细胞比例。f: 免疫荧光分析过表达PtpA及其截短体的 A549细胞的存活情况。标尺，25 μm。g: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中GPX4的转录情况。h: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中PI阳性的细胞比例。i: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中LDH的释放情况。j: 感染MTB及MTB突变菌株的PRMT6+/+和PRMT6-/- U937细胞中脂质过氧化细胞的比例。

6. MTB PtpA诱导的铁死亡促进MTB的致病性和传播：在MTB感染的小鼠模型中，与感染MTB ΔptpA或MTB ΔptpA:ptpAΔ1-50的小鼠相比，感染WT MTB或MTB ΔptpA:ptpA的小鼠肺部表现出更严重的病理损伤和更高的细菌载量，GPX4表达降低以及H3R2me2a修饰和4-HNE（铁死亡标记物）水平升高。但是使用Lip-1处理的小鼠可以消除不同菌株感染产生的铁死亡差异。综上所述，MTB PtpA依赖其PRMT6结合区域，促进铁死亡诱导的肺损伤和MTB的传播。具体见图6。

图6 MTB PtpA诱导的铁死亡促进MTB的致病性和传播。a: 感染MTB及MTB突变菌株的小鼠（5周）肺组织苏木素和伊红（H&E）染色。标尺，200 μm。b: 定量分析肺组织中炎性浸润的情况。c: 定量分析肺组织中分枝杆菌的载量。d: 定量分析脾组织中分枝杆菌的载量。e: 免疫荧光检测感染MTB及MTB突变菌株的小鼠（5周）肺组织中H3R2me2a的表达情况。标尺，200 μm。f: 定量分析免疫荧光中肺组织的H3R2me2a的表达。g: 免疫组化检测感染MTB及MTB突变菌株的小鼠（5周）肺组织中GPX4的表达。h: 定量分析免疫组化中肺组织的GPX4 表达。i: MTB PtpA诱导铁死亡的模式图。

研究结论

综上所述，PtpA依赖于保守的Cys11位点与RanGDP相互作用，从而介导其进入细胞核。核内PtpA直接与PRMT6相互作用，促进H3R2me2a的不对称二甲基化，从而抑制GPX4的表达，最终诱导铁死亡并促进MTB致病和传播。本研究鉴定了诱导宿主细胞铁死亡的MTB关键效应蛋白PtpA，并揭示了PtpA依赖非经典入核机制调控宿主表观遗传进而诱导铁死亡的新机制，进而提出了靶向MTB PtpA-宿主PRMT6界面抑制MTB诱导的铁死亡以减弱MTB致病力及播散的TB治疗新策略。