Western blot (蛋白质印记)技术简介

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1.Western blot简介

Western Blot即蛋白质印迹法，由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的，在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。基本原理包括蛋白质电泳、抗原抗体特异性反应及辣根过氧化物酶（HRP）催化显色等。Western Blot可以通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

Western Blot主要步骤包括电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-显影曝光等步骤，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

2.试剂配制及相关准备

TBST（10X 缓冲液 1L）：Tris base，24 g；NaCl，88 g

Running buffer（10X 0.5L）：Tris base，15.1g；甘氨酸93.75g；SDS，5g

配方链接：

https://wenku.baidu.com/view/f410b54be518964bcf847cfc.html?_wkts_=1676012791897

Trans buffer（1X 1L）：Glycine 2.90 g，Tris 5.80 g，SDS 1g，甲醇 200，ddH2O定容至1 L.（注：小批量的WB实验也可直接用Running buffer配制）

封闭液及抗体稀释液：5% BSA或者牛奶（注：磷酸化蛋白不能用牛奶封闭，奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅）

3.Western blot实验步骤及相关原理：

3.1蛋白样品制备：分为细胞和组织（提取原理相似：主要为通过各种手段将组织/细胞破碎，使蛋白质释放，然后通过高速离心，去除组织/细胞碎片，下面以细胞为例进行讲解）

3.1.1裂解液配制

RIPA裂解液+PMSF（蛋白酶抑制剂）= 100：1

3.1.2裂解细胞，细胞刮刮取细胞（注：加裂解液裂解蛋白前，需将PBS洗干净，否则会稀释蛋白浓度）

3.1.3离心，取上清液（蛋白质在上清中）

3.1.4蛋白质定量：蛋白质定量有双缩脲法、Lowry法、Bardford法和BCA法。这里主要介绍BCA法，其原理：蛋白质可在碱性环境下将2价铜离子还原为1价铜离子，而1价铜离子可以与BCA试剂发生颜色反应，2分子的BCA螯合后可形成紫色的复合物，这种复合物具有非常好的吸光性(用OD值反应)。在562nm的紫外光下，溶液中复合物的OD值与蛋白浓度在一定范围内呈现良好的线性关系。我们可以通过这种线性关系大致地计算出自己的样品中总蛋白浓度。步骤依据各个厂商的试剂盒说明书进行。

3.1.5蛋白变性：加入5X或者1X的蛋白上样缓冲液，96℃以上水浴10min，使蛋白充分变性，解除二级或三级结构，只保留一级链式结构。上样缓冲液一般成分及作用：SDS，可使得蛋白裹上足量的负电荷，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异；DTT还原剂，可打开巯基维持单链的线性结构；甘油，可起沉降作用使得混合的样本沉降到加样孔底部，不会逸散至加样孔以外；溴酚蓝为小分子蓝色物质，有指示作用。

3.2 SDS-PAGE凝胶电泳:

3.2.1 SDS-PAGE凝胶制备：

配方链接：http://www.eiaab.cn/article/show/id/21724.html

原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。在SDS-PAGE凝胶电泳中，蛋白质能够保持完整状态，电泳的速度与蛋白质的分子量大小、结构及其电荷量有关，据此可以将蛋白质分离开。

主要成分：

30%聚丙烯酰胺+Tris-HCL：凝胶主要结构。

过硫酸铵（APS）+N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）（注：神经毒性）：促凝剂

十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子表面活性剂和强还原剂，可以断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。并且可以使蛋白带负电，统一蛋白电性。

凝胶反应方程式：

3.2.2 电泳：恒压，通常设置参数浓缩胶：80V/30min；分离胶120V/1.5h（注：低压先将蛋白压缩到同一平面，高压将蛋白依据不同分子量分离）。

3.3转印

转膜分为半干转和湿转两种类型，其原理均为将凝胶中的蛋白通过电流转移到固相支持物上（注：恒流）。常用的固相支持物包括NC膜和PVDF膜，这两种膜表面都有肉眼不可见的小孔，都可以用来电转印。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜（注：使用前需用无水甲醇活化，活化膜表面的正电基团，使之跟易与负电蛋白结合），易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转印。

3.4封闭

封闭常采用5%的脱脂奶粉或胎牛血清，室温下，摇床孵育膜1-2h。（注：磷酸化蛋白必须使用胎牛血清封闭，因为奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景）。

封闭原理：电转后蛋白质已迁移至膜的表面，此时膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔。此时我们采用牛奶或胎牛血清封闭，其中包含大量的蛋白质，这些蛋白质会吸附在那些小孔上，堵住这些孔。如果没有封闭，那么在下一步我们添加的一抗将同时吸附在目标蛋白和膜表面其它位置，且很难洗掉，最终ECL发光检测时可出现非特异性条带、杂带、高背景等等，浪费抗体不说，还会影响最终的判断。当然，这些奶粉中的蛋白也会一定程度地吸附到目标蛋白表面，但是抗原-抗体特异性反应相比，这种非特异性的结合会很轻松的在后面漂洗步骤中消除。

3.5 抗原-抗体免疫反应

这一步是包括一抗与目的蛋白的免疫反应及二抗与一抗的免疫反应。

首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合。比较重要的是一抗孵育温度和时间，最常用的条件是4℃摇床过夜孵育，温度适宜，分子运动温和。有人也用37℃孵育1-2h，可能会成功，但是温度越高，分子间的运动越激烈，那么出现非特异性杂带的可能性就越高；同时孵育时间较短，也可能会导致一抗与目标蛋白结合不充分。

一抗结合之后，就是采用的二抗，二抗可与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，该底物极强的信号输出能够使皮克量的蛋白得到检测。

就笔者个人经验而言，一抗孵育这一步即是WB中最重要的一步，又是最不重要的一步。特异性高的一抗，WB用脚跑都能跑出来；特异性差的抗体，WB发明人都不一定做得出来。建议不要省钱买国产抗体，你懂得。买抗体之前，看看近年发的高分文章，查查他们用的什么哪个公司抗体。如果找不到参考，一定要买经过该抗体公司敲除验证过的抗体。

3.6 辣根过氧化物酶（HRP）蛋白检测

目前较多采用的是ECL化学发光法，ECL工作液包括A液和B液：鲁米诺和过氧化物，二者避光保存，现配现用(1：1配制)，目标条带将在黑暗环境下发出荧光，荧光会进一步胶片上曝光，荧光越强则胶片上曝光的条带越黑，最后洗出胶片即可。