Green Chem.-高效双酶法合成醛糖酸

醛糖酸是醛糖氧化生成的一类高附加值碳水化合物衍生物。例如，葡萄糖和乳糖的氧化产物——葡萄糖酸和乳酸——由于其抗氧化、抗菌、保湿和螯合特性以及益生元作用，在制药、食品和化妆品行业中得到了广泛应用。然而，由于缺乏有效的合成方法，醛糖酸的广泛应用受到限制。

目前，醛糖酸主要有四种生产方法，生产能力和产品质量各不相同。醛糖的氧化化学合成通常涉及苛刻的化学氧化剂，如卤代酸、卤素或重金属离子。这些氧化剂产生大量的副产物，并污染形成的醛糖酸。电化学氧化可以产生大量的醛糖酸。然而，有害金属催化剂量污染了产品，并形成了非特异性氧化产物。微生物发酵是一种环境友好的方法，可以生产大量所需的化合物，但也有缺点——生产速度较慢，纯化步骤更复杂。就生产效率、产品纯度和环境问题而言，酶促氧化法可能是最可取的。酶法生产醛糖酸在很大程度上依赖于能够氧化醛糖的生物催化剂的可用性。有些生物催化剂，如葡萄糖和乳糖氧化酶，是对一组特定的碳水化合物有活性的特殊酶，并产生过氧化氢作为氧化反应的副产物，过氧化氢又被过氧化氢酶转化为氧气。然而，氧化酶有限的底物特异性和低催化率限制了醛糖酸的生产。

NAD(P)+依赖型醛糖脱氢酶也能将广泛的醛糖氧化为相应的醛糖酸。这类酶的典型例子是来自Thermus thermophilus HB的耐高温NAD(P)+依赖型醛糖-1-脱氢酶和来自Thermoplasma acidophilium的NAD(P)+依赖型醛己糖脱氢酶。这些酶通常比PQQ-或FAD依赖的醛糖氧化酶或脱氢酶慢，并且需要一种昂贵的共底物NAD(P)+的存在。然而，如果结合一些NAD(P)+的再氧化过程，这些酶可以用于生产醛酸。NAD(P)+的再生可以通过多种方式实现，其中最重要的是与某些牺牲底物的酶偶联、电化学和光化学氧化。NAD(P)+再生的酶系统利用谷氨酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶或NADH氧化酶等多种酶及其各自的牺牲底物酮戊二酸和氨离子、丙酮酸、氧。电化学和光化学方法通常需要一些额外的介质来氧化NAD(P)H，这些介质充当NAD(P)H和电极之间的电子穿梭，或者光催化氧化NAD(P)H并将氧还原为过氧化氢。

在本研究中，作者报道了一个来源于Acinetobacter calcoaceticus的基于PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的实际合成醛糖酸的新方案。PQQGDH对各种单体醛糖、二糖和低聚糖具有活性，并接受结构上不同的介质进行酶的再氧化。作者证明了硫堇(TH)是PQQGDH在与过氧化物酶耦合的氧化方案中稳定而有效的氧化还原介质，允许各种醛糖酸的非常高的时空产率。

所提出的依赖于双酶介质的合成醛糖酸的体系如图1所示。当反应混合物的pH高于6.5时，PQQGDH有效地氧化碳水化合物。在生物反应器中使用PQQGDH氧化碳水化合物需要酶的再氧化。然而，用于再生介质的酶，如漆酶，在这个pH值范围内活性较低。为了克服这一瓶颈，研究人员使用了在很宽的pH范围内都有活性的血红素过氧化物酶。作者选择了辣根过氧化物酶（HRP），可以获得该酶与过氧化氢(k_cat/K_M∼10⁷ M⁻¹ s⁻¹)、白硫堇(4.8×10⁸M⁻¹ s⁻¹)和其他底物反应的全面数据。与漆酶介体再生方案相比，该方法使用过氧化氢作为末端电子受体，而不是氧气。在各种生物催化过程中，H₂O₂被认为是一种“绿色”的氧化剂。

图1

H₂O₂可以对HRP产生负面影响-在没有电子供体的情况下，每个HRP分子都会催化~1380个H₂O₂分子的歧化，直到它被灭活。为了避免H₂O₂引起的这种失活，并使HRP能够应用于介体的再氧化，必须严格控制向反应器混合物中添加H₂O₂。因此，作者应用了自制的精密分配器，由传感器控制，用于监测H₂O₂和硫堇的浓度。在替代过程中使用的典型介质是DCPIP和ABTS。它们都不稳定，在氧化酶(如漆酶)的存在下会分解。此外，ABTS是一种阴离子化合物，这使得它与醛糖酸的分离更加复杂。相比之下，硫堇是一种稳定的阳离子染料，它与亚甲蓝有着密切的同源关系，有吸附在各种表面的倾向，即使用活性炭也能很容易地从溶液中回收。

PQQGDH与硫堇和糖类的反应活性。硫堇还原反应的表观双分子速率常数为(2.8±0.3)×10⁶M⁻¹ s⁻¹。这一反应活性与DCPIP观察到的相当，但低于与不稳定的电子受体如吩嗪甲硫酸盐(PMS)和有机化合物的阳离子自由基的反应活性。在0.4 mM的浓度下(含10 mM的葡萄糖)没有观察到硫堇对PQQGDH的抑制作用。以0.22 mM和0.41 mM硫堇作为最终电子受体，实验测定了PQQGDH催化氧化各种糖类的表观参数(参数列于表1和表2；纤维二糖和木糖的实验数据如图所示)。值得注意的是，PQQGDH催化糖的氧化是一个复杂的过程。因此，这里的V_max、K_m和K_i参数仅反映了PQQGDH的近似动力学。然而，这些参数表明，PQQGDH很容易氧化各种糖类。

根据底物的抑制特性，将糖分为两组。第一组由葡萄糖、乳糖、半乳糖和纤维素二糖组成，它们在浓度高于20 mM时可以抑制PQQGDH。通过将这些底物的浓度保持在最佳值，可以实现这些底物的最佳氧化速率(表1和表2)，因此，这些底物是在补料分批过程中氧化的。第二组底物如来苏糖、木糖、核糖和脱氧核糖的活性较低，这组的抑制程度明显较低。因此，使用间歇反应器对这些底物进行氧化。

加料式反应器和间歇式反应器中糖氧化制醛糖酸的效率。总酶周转数(TTN_E)和平均酶周转数(ATN_E)这两个术语最能准确地描述酶的作用。以葡萄糖为模型底物，对合成醛酸的方法进行了初步优化。作者考察了pH、钙离子、介体硫堇、PQQGDH和HRP浓度对葡萄糖酸内酯/葡萄糖酸生产效率的影响(表3)。使用0.41 mM的硫堇和100 mM的CaCl₂，在pH 8.0和25°C条件下，经过约6小时的生产时间后，在补料分批反应器中获得了最高的总酶周转数(TTN_E) 10⁷。在ph7.0条件下，转化效率相似(TTN_E为9.0 × 10⁶)(表3)。对PQQGDH活性的分析显示，在补料分批生产过程中，PQQGDH活性早期下降了~ 60%。在pH为8，CaCl₂浓度为5 mM或100mM时，酶活力进一步下降，最高可达∼的25%，而在pH值为7时，酶活可避免下降，并保持了初始催化能力的40%(图2)。对PQQGDH突然早期部分失活的这种奇怪动态的进一步研究得出结论，这种明显的失活是由用于容纳反应的玻璃器皿上的酶吸收引起的。为了证明这个假设，作者放大了典型的反应体积32倍至800 mL，使用79 nmol的酶而不是0.8 nmol。在大体积反应器的情况下，在葡萄糖酸生产实验的6小时内，PQQGDH活性没有下降(图2)。

图2

在pH值为7的含5 mM CaCl₂的缓冲溶液中进行分批补料生产实验，结果表明，与在含100 mM CaCl₂的相同缓冲溶液中相比，TTN_E降低了30%(表3)。这一观察结果与使用5 mM和100 mM CaCl2时的PQQGDH动力学参数一致(表2)。较高的CaCl₂浓度(即100 mM)不会影响PQQGDH在pH 7时的稳定性，但它们提供了更高的离子强度，从而提高了酶的效率。然而，如果在生产过程中使用大量的盐是不可取的，可以使用低浓度的CaCl₂，而不会对总产量产生严重影响。

反应效率的另一个重要变量是氧化还原介体硫堇的浓度。其浓度加倍使TTN_E增加两倍（表3和4）。然而，氧化形式的硫堇的溶解度有限，约为 0.8 mM，具体取决于缓冲溶液的 pH 值和离子强度。在还原形式下，硫堇的溶解度在微摩尔范围内，这进一步需要快速氧化硫堇的酶，如过氧化物酶。这种溶解度问题通常会限制介体在较高浓度下的应用。

其他底物在pH 7的缓冲溶液中进行生产，其中5mM CaCl₂/0.22 mM硫堇和100 mMCaCl₂/0.41 mM的硫堇。不同底物的生产效率不同，取决于PQQGDH对糖的氧化速率常数(V_max/K_m，表1)。缓慢氧化的底物，如脱氧核糖和来苏糖，允许达到∼2×10⁵的TTN_E值。核糖、木糖、半乳糖、乳糖和纤维二糖被氧化，TTN_E大于10⁶(表4)。为了验证糖的氧化产物，作者对转化前后的样品进行了分析。根据高效液相-质谱仪分析，单糖和双糖的转化形成了比底物高16Da的单一产物。在酶促氧化前的反应混合物中，没有发现任何典型的氧化产物分子离子(图3)。在对脱氧核糖、核糖、木糖、葡萄糖和粘糖氧化产物进行纯化后，作者进行了¹H和¹³C核磁共振分析，确定这些产物为醛糖酸。

微生物发酵乳糖生成乳糖酸的研究表明，从~1 g L⁻¹ h⁻¹(时空产量，用总产量除以生产时间和反应体积计算)到~7 g L⁻¹ h⁻¹，滴度高达400g L⁻¹，这取决于用于乳糖转化的酶，生物催化氧化法的时空产量从0.1g L⁻¹ h⁻¹到27 g L⁻¹ h⁻¹。

在本研究中，用该方法生产乳糖酸的TTN_E为3.5 × 10⁶，ATN_E为5.75×10⁶ h⁻¹，对其他糖类的氧化效率与表4相似。总而言之，观察到的时空产率为~ 2 g L⁻¹ h⁻¹，其中来苏糖的最低产率为1.0 g L⁻¹ h⁻¹，木糖的最高产率为~ 11 g L⁻¹ h⁻¹。为了证明该方法在生产氧化糖方面的更广泛的适用性，作者证明了半乳低聚糖的混合物也可以转化为相应的醛糖酸，TTN_E为6.1×10⁵。

文章信息：

DOI: 10.1039/d2gc00823h