简单有效！把内含子引入Cas12a中，可增强基因编辑和基因靶向效率

近日，Plant Biotechnology Journal在线发表德国卡尔斯鲁厄理工学院植物研究所团队题为“Enhancing gene editing and gene targeting efficiencies in Arabidopsis thaliana by using an intron-containing version of ttLbCas12a”的论文，该研究将10个拟南芥中的短内含子引入ttLbCas12a的编码序列中，构建了包含内含子的ttLbCas12a变体（ttLbCas12a-i），旨在增强基因编辑和基因靶向效率。

研究人员将带有典型供体和受体位点（AGGT）的拟南芥基因中的短内含子以200-400nt的平均距离放置于ttLbCas12a的编码序列中。由于ttLbCas12a的大小比SpCas9小，有10个内含子被引入编码区，为了提高剪接效率，研究人员使用NetGene2内含子剪接位点预测软件对所得ttLbCas12a-i ORF进行优化。

接着，研究人员选择ttLbCas12a编辑效率低的七个目标位点 ，以比较ttLbCas12a-i和ttLbCas12a的编辑效率。两个位点位于ECA3基因中，五个位点位于邻近着丝粒I、III和IV的异染色质、着丝粒周围DNA。研究人员用蘸花法将含有crRNA以及两个变体的T-DNA转入到拟南芥中，并将转基因植物在22°C下生长两周。发现ttLbCas12a-i在每个目标位点编辑效率显著超过了ttLbCas12a，对于ttLbCas12a编辑效率很低的三个目标位点，ttLbCas12a-i编辑效率是ttLbCas12a的3.0-6.8倍。总体而言，ttLbC as 12a-i的效率是ttLbCas12a的1.3倍至6.8倍。

基于以上结果，研究人员在拟南芥中使用乙酰乳酸合成酶（ALS）选择系统来判断ttLbCas12a-i 是否能进一步提高GT效率， 发现，ttLbCas12a-i的总GT效率是与ttLbCas12a的2.7倍，ttLbCas12a只有不到三分之一的阳性单株的GT效率高于1%，而ttLbCas12a-i超过四分之三的阳性单株GT效率高于1%。因此，ttLbCas12a-i提高了拟南芥中的基因编辑效率和GT效率，使一些难以编辑的位点变得可编辑。

图1 利用ttLbCas12a-i改进基因编辑和GT

研究人员认为ttLbCas12a-i使一些难以编辑的位点变得可编辑是由于细胞中存在更大量的核酸酶。这种表达增强是不依赖于启动子的，可以使ttLbCas12a-i成为植物界的一种有价值的新工具，该工具在多基因编辑等方面是有发展前景的。此外，ttLbCas12a-i的使用还能提高对培养温度有要求的生物的基因编辑效率。

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13964

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