含虾青素的壳聚糖/聚乙烯醇/氧化石墨烯静电纺丝纳米纤维膜

组织工程在再生医学中得到了广泛的应用，组织工程支架已成为牙周再生修复的新研究方向。我们的目标是开发一种能够支持宿主免疫和促进牙周再生的生物支架材料。本文采用静电纺丝法制备了壳聚糖（CS）/聚乙烯醇（PVA）/氧化石墨烯（GO）/虾青素（ASTA）纳米纤维膜。CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜具有良好的微形态、良好的力学性能，无细胞毒性。静电纺丝产生的纳米纤维膜因其高孔隙率和较大的比表面积而受到人们的关注。细胞膜的三维支撑结构可以模拟天然细胞外的基质，有利于细胞的生长、粘附和增殖。基于CS等生物聚合物的纳米复合材料由于其优异的特性，被选择用于生物材料支架的设计。GO具有良好的力学性能，静电纺CS/PVA/GO复合纳米纤维膜改善膜在模拟生物流体的稳定性，在组织中具有轻度炎症反应和优异的生物相容性。虾青素（ASTA）是一种由微藻/浮游生物合成的脂溶性酮-类胡萝卜素，具有很强的抗氧化和抗炎作用。旨在开发一种通过静电纺丝改善牙周炎症微环境来促进牙周组织再生的纳米纤维膜。

图1.纳米纤维、膜纤维的表征。(A)为SEM图像，(B)为纤维直径对应的正态分布。红色的圆圈表示融合的纤维。各组分及其在各组中的比例：a.CS：PVA = 10：90 b.CS: PVA：GO = 10：90：0.5，c.CS：PVA：ASTA = 10：90：5，d.CS：ASTA=10：90：0.1：5①，e.CS：PVA：GO：ASTA=10：90：0.5：5②。

纳米纤维膜的平均纤维直径不同，但均具有良好的纤维结构，直径分布均匀，孔隙率高。CS/PVA纳米纤维膜（图1a）直径均匀，纤维之间没有珠子、纺锤体或其他形态。随着氧化石墨烯的加入，CS/PVA/GO纳米纤维膜的平均纤维直径（图1b）显著减小，纤维之间出现了纺锤体（白色箭头）。由于氧化石墨烯是一种导电性良好的纳米级填料，它使静电纺丝流体在电场中具有较强的拉伸作用，从而导致纤维直径减小。当将ASTA作为脂溶性物质加入到纺丝溶液中时，纺丝溶液的自纺丝性降低。加入增溶剂DMSO后，溶液粘度增加，CS/PVA/ASTA纳米纤维膜的纤维直径（图1c）增加。同时，由于增溶剂DMSO的加入，纤维之间发生了融合（如红色圆圈所示）。随着CS/PVA/ASTA纳米纤维膜中氧化石墨烯含量的增加（图1d，e），在CS/PVA纤维之间的纤维之间出现了纺锤体，平均纤维直径下降。

图2.拉伸试验结果。各层膜的抗拉强度均有统计学差异。 1.CS/PVA纳米纤维膜2.CS/PVA/GO纳米纤维膜3.CS/PVA/ASTA纳米纤维膜4.CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜①5.CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜②。

CS/PVA纳米纤维膜的抗拉强度（图2-1）为2.57 MPa，但GO将CS/PVA/GO纳米纤维膜的抗拉强度降低到2.24MPa（图2-2）。通过电子显微镜图像（图1A）证实，这种强度的下降与直径相一致。CS/PVA/GO纳米纤维膜的平均直径小于CS/PVA纳米纤维膜，纳米纤维之间的纺锤体结构降低了单个纤维的机械强度，导致CS/PVA/GO纳米纤维膜的抗拉强度下降。CS/PVA/ASTA纳米纤维膜的抗拉强度（图2-3）为3.39 MPa，是所测试的纳米纤维膜中最高的。电镜图像显示，CS/PVA/ASTA纳米纤维膜的纤维直径最大，且纳米纤维具有融合接触。此外，虾青素含有羟基，与聚乙烯醇和壳聚糖具有相互作用，增加了纤维的结晶度和纳米纤维膜的机械强度。然而，随着CS/PVA/ASTA纳米纤维膜中氧化石墨烯含量的增加（图2-3、4、5），由于纤维直径的减少，纳米纤维膜的抗拉强度逐渐降低。综上所述，CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜具有良好的抗拉强度，这对制备敷料和指导再生膜具有重要意义。

图3.(A，B)不同纳米纤维膜的FTIR曲线。

如图3A所示，CS和PVA的红外光谱在3640-2978cm−1处具有伸缩振动（O-H）和（N-H）。CS在2862cm−1（C-H）处有伸缩振动，在1651和158cm−1处分别有氨基I和II峰。PVA在1725cm−1处有残余酯基（C-O）伸缩振动，在1252cm−1处有弯曲振动（C-H）。ASTA的红外光谱，1653cm−1有强烈的伸缩振动铌基地（C-O），有一个重要的振动碳双键（C=C）六元环1553cm−1，和977cm−1C-H吸收峰值CC共轭系统。如图3b所示，虾青素削弱吸收峰值在3640-2978cm−1和1587cm−1的峰值，表明虾青素有强大的氢键与壳聚糖和聚乙烯醇纤维膜，并扰乱了壳聚糖和聚乙烯醇的晶体形态。虾青素特征吸收峰的消失表明，在壳聚糖、聚乙烯醇和氧化石墨烯形成的“笼”结构中，其碳基（C=O）的伸缩振动或弯曲振动是有限的。

图4.不同纳米纤维膜的抗菌率。白色条表示对金黄色葡萄球菌的抑制，黑色条表示对大肠杆菌的抑制。1.CS/PVA纳米纤维膜2.CS/PVA/GO纳米纤维膜3.CS/ PVA/ASTA纳米纤维膜4.CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜①5.CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜②

CS/PVA纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌的抑菌率为79.42%，对大肠杆菌的抑菌率为65.75%。但加入氧化石墨烯后，CS/PVA/GO纳米纤维膜对两种菌的抑菌率均降低；对金黄色葡萄球菌的抑菌率为40.96%，对大肠杆菌的抑菌率为52.36%。CS的抗菌作用主要取决于其氨基，其氧化石墨烯结构中含有大量的羧基、双键等官能团，可能与氨基结合来抑制CS的抗菌作用。CS/PVA/ASTA纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌的抑菌率为25.38%，对大肠杆菌的抑菌率为21.25%。虾青素羟基与CS氨基的结合显著抑制了CS的抗菌作用。在CS/PVA/GO/ASTA中加入氧化石墨烯可以提高了膜的抑菌率。该膜对大肠杆菌的抑制作用大于对金黄色葡萄球菌的抑制作用。总体而言，含氧化石墨烯的CS/PVA/ASTA纳米纤维膜提高了抗菌性能，对大肠杆菌有明显的抑制作用。

图5.细胞毒性试验结果。不同时间点的细胞膜与细胞膜孵育后的细胞存活率。没有一种纳米纤维膜表现出细胞毒性。白色条是空白对照组，其他条代表不同的纳米纤维膜。 1.CS/PVA纳米纤维膜2.CS/PVA/GO纳米纤维膜3.CS/PVA/ASTA纳米纤维膜4.CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜①5.CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜②。

用CCK8测定法表征了纳米纤维膜的细胞毒性。图5显示了不同纳米纤维膜和细胞培养24、48和72 h后的细胞活性。培养24 h后，CS/PVA纳米纤维膜上的细胞活性为98.51%，而CS/PVA/GO纳米纤维膜上的细胞活性为98.24%。CS/PVA/ASTA纳米纤维膜的细胞活性为98.09%，随着CS/PVA/ASTA纳米纤维膜中GO含量的增加，纳米纤维膜的细胞活性逐渐提高至99.59%。所有纳米纤维膜的细胞毒性都很小，细胞活力大于98%，在48和72小时内保持高水平。纳米纤维膜具有良好的细胞相容性，CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜具有在人体组织等领域的应用潜力。

力学试验结果表明，该纳米纤维膜具有良好的机械强度。纳米纤维膜在抑菌试验中对大肠杆菌有明显的抑制作用，且在细胞毒性试验中具有良好的细胞相容性。这些结果表明，CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜可用于后续的生物实验，研究牙周再生的机制，观察该膜是否能促进巨噬细胞极化，改善牙周微环境，促进牙周组织再生。这些未来的测试将确定CS/PVA/GO/ASTA纳米纤维膜是否有治疗牙周炎的潜力。

以上内容发表在Journal of Applied Polymer。论文的第一作者是来自哈尔滨医科大学的Hengfang Zhang。通讯作者是来自哈尔滨医科大学的Rong Song。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/app.50166