利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存(细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，)，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%-15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。

想一下，菌种保存常用的两种方法？1.固体斜面培养基临时保藏 2.甘油管藏(-20℃)

步骤

（一）细胞冻存

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；

2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；

4. 离心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

（二） 细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；

5. 次日更换一次培养液，继续培养。

注意事项

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

二甲基亚砜

二甲基亚砜结构式

一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭液体，可燃，带有苦味。凝固点18.4℃，沸点189℃，与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。

细胞冻存中的应用

在细胞冻存中的应用二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。在低温（零下200度）保存细胞时冻存过程中，为防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤，要使用含有DMSO冷冻保护剂。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。超低温时二甲基亚砜的细胞毒性受到抑制。复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。二甲基亚砜（DMSO）是最好的细胞冻存保护剂，

它是一种渗透性保护剂，对细胞毒性小，分子量小，溶解度好，能迅速透入细胞，降低冰点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。

纯二甲基亚砜的冰点是18.45℃,含水40%的二甲基亚砜-60℃不冻,

在医疗中的应用

DMSO对许多药物具有溶液性、渗透性、本身具有消炎、止痛，促进血液循环和伤口愈合，并有利尿、销静作用。能增加药物吸收和提高疗效，因此在国外叫做“万能药”。各种药物溶解在DMSO中，不用口服和注射，涂在皮肤上就能渗入体内，开辟了给药新途径。

1.抗炎
发炎是组织对直接外伤(筋肉扭伤、刀伤、灼伤、震动、辐射等)或间接伤害(如感染)的反应。发炎涉及到疼痛、发热、泛红、肿胀和丧失功能。这是机体包围受伤部位的特殊方式，以便机体修护患处。DMSO能够减低发炎的严重度。
DMSO可以改善全身的血液循环。它似乎可以扩张大血管，收缩毛细血管床。这有助于减少患部的肿胀和体液渗出，同时增加身体排除患部毒素和废物的能力。DMSO可以使需要几周才能复原的伤势，缩减为几天。

2.抗菌
DMSO并不是高效的全能消毒剂，但它有中度的抗菌效果。35%的DMSO溶液可抑制广泛的细菌和真菌(fungi)生长。它也会使某些病菌对抗生素更加敏感。曾经有一项研究显示，5%的DMSO溶液可以使肺结核杆菌对「链霉素」(streptomycin,肺结核药)的敏感性增加200倍。

3.利尿
从皮肤着手，DMSO只有轻微的利尿效果；但适当的注射，就可以成为最强的利尿剂之一。在某些案例中，它增加了尿量10倍。DMSO对水的强亲和力把过量的液体摄入到血液里，然后经由肾脏过滤排出。严重的头部和脊髓受伤会引起脑水肿和脑细胞肿胀，造成颅内压力增加和永久性神经受损；DMSO作为脱水剂、利尿剂可能就是这类患者的救星。