CRISPR 方法无需病毒载体即可提高效率和产量

新开发的 CRISPR 系统使用结合了 Cas9 靶序列的单链 DNA (ssDNA) HDR 模板 (HDRT)，相对于 dsDNA，敲入效率和产量提高了两到三倍。此外，这种不依赖病毒载体的方法允许科学家将特别长的 DNA 序列引入细胞基因组中的精确位置。

这项工作发表在Nature Biotechnology上的论文 “使用混合 ssDNA 修复模板和小分子鸡尾酒在原代细胞中进行高产基因组工程”。

“多年来，我们的目标之一是以不依赖病毒载体的方式将冗长的 DNA 指令放入基因组中的目标位点，”格莱斯顿-加州大学旧金山分校研究所所长 Alex Marson 医学博士说基因组免疫学。“这是朝着下一代安全有效的细胞疗法迈出的一大步。”

Marson 和他的同事们不仅描述了这项技术，而且展示了它如何用于产生具有抗多发性骨髓瘤（一种血癌）潜力的 CAR-T 细胞，以及重写基因序列，其中突变可能导致罕见的遗传性免疫疾病.

“我们表明，我们可以在一次运行中设计超过 10 亿个细胞，这远高于我们治疗个体患者所需的细胞数量，”Marson 实验室临床研究员、医学博士 Brian Shy 说。

“使用病毒载体既昂贵又耗费资源，”Shy 说。“基因工程非病毒方法的一个主要好处是我们不受成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。”

使用具有 Cas9 靶序列的高浓度双链 DNA (dsDNA) 来提高 CRISPR 介导的插入效率可能对原代细胞有毒。即使在相对较高的浓度下，单链 DNA 对细胞的毒性也较小。在新方法中，研究人员描述了一种将修饰的 Cas9 酶连接到单链模板 DNA 的方法，方法是在末端添加一小段双链 DNA 突出端。

“这为我们提供了一种平衡的、两全其美的方法，”Marson 说。

与旧的双链方法相比，单链模板 DNA 可以将基因编辑效率提高一倍以上。分子的双链末端让研究人员可以使用 Cas9 来增强非病毒载体向细胞的传递。

“这项技术有可能使新的细胞和基因疗法更快、更好、更便宜，”加州大学旧金山分校实验室医学助理教授兼 Gladstone 附属研究员 Jonathan Esensten 医学博士说。

在这项研究中，研究人员使用新的 DNA 模板生成了超过 10 亿个针对多发性骨髓瘤的 CAR-T 细胞。大约一半的 T 细胞获得了新基因，并因此转化为 CAR-T 细胞。

“我们知道，将 DNA 模板靶向基因组中的特定位置，称为 TRAC 位点，将提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤效力，”血液学部医学助理教授Justin Eyquem 博士说加州大学旧金山分校的肿瘤学和格莱斯顿的附属研究员。“这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现这一目标，这将加速下一代 CAR-T 细胞疗法的开发。”

此外，研究人员表明，他们的方法首次可以完全替换与罕见遗传免疫疾病相关的两个基因，即 IL2RA 和 CTLA4 基因。

过去，科学家们已经证明他们可以替换特定患者发生突变的 IL2RA 基因的一小部分。现在，Marson 的团队证明他们可以一次替换整个 IL2RA 和 CTLA4 基因——一种“一刀切”的方法，可以治疗这些基因中具有不同突变的许多患者，而不必为每个患者的突变生成个性化模板。用这种基因工程方法处理的近 90% 的细胞获得了健康版本的基因。

研究人员现在正在寻求批准在 CAR-T 细胞治疗和 IL2RA 缺乏症治疗中使用非病毒 CRISPR 技术推进临床试验。