南大曹毅、王炜和华工边黎明合作《AM》：设计光响应配体系绳用于干细胞机械调节

在体内，干细胞的功能受其周围细胞微环境动态调节，它们不仅为细胞提供物理支撑，还提供各种生化和生物物理线索。可时空调节干细胞功能的工程仿生材料对基础研究和转化研究（如干细胞治疗）具有重要有价值。传统的合成材料无法完全模拟细胞周围环境的动态生化和生物物理线索。近年来，干细胞行为的动态调控策略得到了极大的扩展，这些方法需要生物活性配体的时空显示或通过外部触发器（如pH、温度、电场、磁场、和光）改变材料的物理/化学性质。在这些方法中，光刺激是特别有前景的，因为它允许细胞粘附和迁移的无创、按需和时空分辨调节。此外，通过改变光剂量或使用不同波长可以实现更复杂的光控制。

鉴于此，南京大学曹毅教授/王炜教授和华南理工大学边黎明教授等人基于生物活性配体可以通过将它们与底物的系绳长度增加到超过临界长度而在机械上“隐形”，从而提供了一种在不改变生化条件的情况下调节机械转导的方法，合理设计了光可切换系绳，其长度可以通过在单体和二聚体状态之间切换光响应蛋白 pdDronpa 来可逆地调节。通过光在明确定义的生化和物理特性的基质上调节干细胞的粘附、扩散和分化，进一步证明了同一基质上不同细胞命运的时空调节。相关工作近期以题为“Engineering Photoresponsive Ligand Tethers for Mechanical Regulation of Stem Cells”发表在了《Advanced Materials》上。

【光开关系绳的设计】

光可切换系绳（LST）的设计如图所示。LST的N-末端由SpyTag序列组成，该序列允许系绳通过SpyCatcher SpyTag化学与玻璃基板共价连接。C-末端包含一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，可与细胞表面的整合素结合。LST的中心由随机卷曲的弹性蛋白样肽（ELP）序列组成，其中一部分被Lin及其同事设计的光开关二聚体pdDronpa的光响应蛋白二聚体绕过。在488和405 nm光照下，系绳长度可在“长”（175或245 nm）和“短”（105 nm）状态之间可逆切换。

设计原理示意图

【单分子原子力显微镜（AFM）测量系链长度】

为了确定干细胞如何响应不同长度的配体系绳，设计并工程化了具有不同串联重复ELP的配体系绳。ELP序列采用无规卷曲构象，在拉伸时可以完全拉长。随着ELP重复次数的增加，43 pN处的延伸也单调增加，表明随着系绳长度的延长，激活整合素需要增加时间和位移。短配位体系绳的力-伸长曲线通常比长配位体系绳的力-伸长曲线具有更陡的斜率，这表明短配位体系绳在分子水平上表现出比长配位体系绳更高的弹性。因此，配体系绳长度可被视为影响干细胞粘附的局部刚度。

AFM力学表征

【通过系绳长度调节细胞行为】

为了检测细胞对不同RGD系绳长度的假定效应的反应，使用这些系绳以相同的细胞密度涂覆玻璃基板研究了人类间充质干细胞（hMSCs）对不同系绳长度的反应。结果表明，在没有RGD的情况下，细胞不能很好地粘附在对照表面（图2）。在含有RGD的系绳存在的情况下，随着系绳长度的增加，细胞扩展面积、周长、圆度和附着细胞数量单调减少。配体系绳长度基本上控制了细胞的机械反应，与AFM结果一致。

hMSCs对不同长度系绳的响应

【单分子AFM表征LST】

在确定关键配体系链长度以改变不同的hMSCs粘附行为后，设计了具有两个过渡长度的LST，即pdDronpa解离时的ELP10和ELP14。ELP10和ELP14由四个和八个ELP重复序列组成，分别由pdDronpa二聚体夹在中间，两个和四个ELP重复序列在Dronpa二聚体的N端和C端携带SpyTag和RGD，分别形成pdDronpa-ELP10-RGD和pdDronpa-ELP14-RGD。当pdDronpa在488nm光照下解离时，pdDronpa-ELP10-RGD和pdDronpa-ELP14-RGD在488nm光照下的轮廓长度增加了57.4 ± 36.7及≈101.5 ± 54.5 nm，与ELP重复序列的长度变化很好地匹配。

单分子AFM测量两个LST的长度转换

【LST调控hMSCs粘附行为的研究】

实验评估了LST的光诱导构象变化是否可以调节hMSCs的行为，并探索了利用光来控制LST涂层表面hMSCs的活性。观察到在ELPn RGD或pdDronpa ELPn RGD上培养的细胞在培养24小时内表现出高度存活率（>90%），表明pdDronpa和ELP均未诱导显著的细胞毒性。然后确认488或405nm光照不会改变ELPn RGD涂层表面上hMSCs的活性。免疫荧光染色显示，随着配体系绳长度的增加，肌动蛋白聚合和核定位YAP比率降低。这些结果表明，配体系绳长度直接影响细胞内和核活动。重要的是，在488nm光照下， pdDronpa-ELP10-RGD或pdDronpa-ELP14RGD上培养的细胞显示出显著减少的细胞扩散面积和核定位YAP比率，但随后的405 nm光刺激挽救了这种减少。因此，在不改变生物化学环境的情况下，利用光可以可逆地微调hMSCs的机械转导信号。

用LST-s调控hMSCs的机械传导

【LST调控hMSCs谱系】

将hMSCs铺在用不同长度的RGD系绳固定的盖玻片上，并暴露于支持成骨和成脂诱导培养基中。在诱导培养基中培养一周后，碱性磷酸酶（ALP）活性和油红染色所示，hMSCs经历了实质性的成骨和成脂肪分化。系绳长度改变了hMSCs命运的平衡，在系绳相对较短的表面上有利于成骨细胞系，而在长系绳上脂肪细胞分化增强。这些结果表明，机械信号通过较短的系绳有效地传递，有助于hMSCs的成骨分化。在488nm的激发下，由于系绳从“短”状态切换到“长”状态，hMSCs发生脂肪分化。在405nm的激发下，由于系绳从“长”状态切换到“短”状态，hMSCs分化为成骨细胞。

光刺激可逆地控制hMSCs的分化

【LST时空控制hMSCs分化】

为了进一步实现时空控制hMSCs成骨/成脂肪分化的目标，分别制备了两个具有矩形和圆形骨架的光掩模，并且光照射仅允许通过细胞接种后的雕刻区域。首先将hMSCs接种在用pdDronpa-ELP10-RGD固定的基质上，该基质在488 nm的辐射下暴露1小时。在培养箱中放置24小时以确保充分的细胞粘附后，用雕刻掩模覆盖的基质暴露于405nm的辐射下1小时。培养10d，固定细胞，免疫荧光染色成像。表明位于405nm光照射区域的细胞表达高水平的RUNX2（晚期成骨分化的标志物）和低水平的PPARγ（脂肪分化的标志物），在488nm光激发下观察到相反的结果。这些发现表明，光学驱动平台有效调节干细胞以微米空间分辨率分化为特定谱系。

光对hMSCs分化的空间控制

https://doi.org/10.1002/adma.202105765

来源：高分子科学前沿

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