《Cell》MIT：基于水凝胶的组织转化技术的基本原理及其应用

【摘要】

新兴的组织转化技术为原位研究系统级分子和解剖学特征提供了前所未有的机会。基于水凝胶的方法设计物理化学组织特性，使完整器官光学透明，大小和形状可调，同时在其生理位置保留生物分子。

当与先进的分子工具、标记和成像技术相结合时，组织转化能够以越来越快的速度和分辨率对分子、细胞及其相互关系进行三维 (3D) 映射。最近，麻省理工学院（MIT）Kwanghun Chung教授团队综述讨论了组织转化和标记技术的基本工程原理及其广泛的应用、当前的挑战和未来的潜力。相关综述论文以题为Basic principles of hydrogel-based tissue transformation technologies and their applications发表在《Cell》上。

【图文解析】

基于水凝胶的组织转化技术和特性

基于水凝胶的组织转化方法改变了组织-凝胶混合物的物理化学特性，以允许跨多个尺度有效保存和提取生物信息，揭示从宏观器官范围特性到纳米级亚细胞结构的信息（图 1A-1D）。为了有效地操纵组织凝胶特性，对这些技术背后的基本化学和物理原理有更深入的了解至关重要。在该节中，团队介绍两大类水凝胶技术：生物分子间固定方法，它创建交联生物分子的内部网格，以及基于合成水凝胶的方法，它创建具有集成生物分子的外源性水凝胶网格支架。了解每组方法如何增强物理化学特性的保存和操作，将使研究人员能够合理地选择和优化其所需应用的方案。

图 1 组织-水凝胶转化实现的多尺度分子和结构研究。下面的灰色条显示了基于水凝胶的组织转化技术覆盖的尺度。(A)全脑和远程电路。(B)细胞结构和局部电路。(C) 组织微环境。(D)突触连接。

基于生物分子间固定的方法

在基于生物分子间固定的方法中，添加化学添加剂以在组织内的生物分子之间形成化学键，以稳定组织结构和生物分子免于降解。甲醛是多聚甲醛 (PFA) 的一种单体形式，是商业、医疗和学术环境中使用最广泛的组织固定剂。甲醛快速渗透组织，与生物分子反应缓慢，使这种化学物质特别适合大规模组织的均匀固定。甲醛与核酸和蛋白质的胺基反应形成可逆的羟甲基加合物，然后与其他生物分子的亲核试剂发生不可逆反应，形成由亚甲基桥连接的分子间网状结构（图 2A 和 2B）。然而，甲醛分子的小尺寸和单功能性限制了分子间交联的程度，导致在大多数组织转化方法所需的组织脱脂过程中细胞膜破裂时生物分子和组织结构的损失。

图 2 常见组织水凝胶技术概述。

基于合成水凝胶的方法

在基于合成水凝胶的技术中，生物分子要么与外部聚合物网共价结合，要么被物理包裹在外部聚合物网中（图 2C-2G）。与生物分子间固定方法一样，最初开发基于合成水凝胶的技术是为了提供一种稳健保存生物分子和组织结构的方法；然而，研究人员此后探索了利用水凝胶特性（例如，可扩展性和弹性）来克服组织表型分析中的独特挑战的新方法。团队将合成水凝胶技术分为三种类型：（1）基于 CLARITY 的方法，（2）基于膨胀的方法，以及（3）基于物理纠缠的方法。

基于水凝胶的组织转化优化标准

团队已经审查了各种基于水凝胶的技术，这些技术专门用于探测所需范围和规模的生物系统。在这里，讨论了基本的水凝胶特性，并解释了如何设计它们以帮助研究人员为他们自己的特定系统和目标选择或优化组织转化方法。

基本的水凝胶特性

水凝胶特性对于最大化可以从感兴趣的样本中提取的生物信息量非常重要。在优化组织凝胶混合物时，需要考虑四种基本的水凝胶特性（图 3A）：

图 3 组织凝胶特性的优化。

机械韧性

这是一种材料在高应力下承受断裂的能力（强度的衡量标准），即使变形到高应变（可变形性的衡量标准），它通常被量化为材料应力-应变曲线下方的面积（图 3D）。 对于大多数组织转化应用，需要坚固但不可变形（即中等韧性）的刚性组织凝胶（图 3E）。然而，保持高强度同时具有高度可拉伸性或可压缩性的更坚韧的组织凝胶显着降低脆性、更耐损坏且不易撕裂（图 3F）。

将基于水凝胶的方法扩展到体积样品的挑战

水凝胶网的一个重要作用是在脂质去除步骤（脱脂）期间将生物分子固定在其生理位置。 内源性脂质层充当物理和光学屏障，分别阻止分子探针和光子的细胞内递送（图 4A）。因此，不同程度的脱脂已被用于组织清除和转化方法，以增加生物组织的分子渗透性和光学透明度。特别是基于合成凝胶的方法，允许使用强洗涤剂完全脱脂，因为即使在完全去除脂质双层后，水凝胶网也可以防止生物分子及其空间组织的损失（图 4A）。

图 4 组织清除和分子递送的基本原理。

组织转化技术的应用

空间转录组

分析各种细胞类型的空间组织及其基因表达对于理解复杂生物系统中的结构-功能关系至关重要。原位转录组学技术的最新进展使基因表达的空间映射变得越来越高分辨率和多路复用。例如，smFISH 可以在其天然组织环境中以单细胞分辨率绘制单个 RNA 分子（图 5A 和 5B）。smFISH 中的空间、光谱和顺序条码方法已经能够在单个细胞中绘制许多 RNA 种类（图 5C 和 5D）。

图5 基于杂交的空间转录组分析概述

另一种原位转录组学方法直接在感兴趣的细胞/组织内对 mRNA 进行测序。例如，原位测序（图 6A）和荧光原位 RNA 测序（FISSEQ）（图 6B）在生物样品中生成互补 DNA (cDNA) 扩增子，并通过反复杂交和成像荧光探针对扩增子进行测序。同样，水凝胶辅助的原位测序方法，空间分辨转录扩增子读出映射（STARmap），直接在厚组织内生成 cDNA 纳米球（扩增子）（图 6C 和 6D）。

图6 基于测序的空间转录组分析概述

蛋白质组

蛋白质组成像技术的最新进展克服了这些挑战，使研究人员能够从组织切片中提取前所未有的蛋白质组学细节。例如，Angelo 等人，2014 年通过使用多路复用离子束成像 (MIBI) 和基于质谱的检测在 4 微米厚的组织切片中同时对 10 个金属标记抗体（可扩展到 100 个目标）进行成像，研究了肿瘤组织中的细胞异质性(图7A和7B)。这些金属标记方法只需要一轮抗体孵育，而基于质谱的方法没有自发荧光，这使得它们成为绘制薄组织切片中二维蛋白质分布图的有吸引力的选择。类似地，包括 CODEX（Goltsev 等人，2018 年）、可扩散探针（Guo 等人，2019 年）和 Immuno-SABER（Saka 等人，2019 年）在内的条形码方法能够使用寡核苷酸文库对组织切片进行单轮标记-偶联抗体，用独特的核苷酸序列编码每个靶标（图 7C 和 7D）。然后使用荧光核苷酸杂交的重复循环对标记的抗体进行成像，从而使同一薄组织切片内的数十个目标能够可视化。对于 3D 蛋白质组学组织分析，阵列断层扫描已被广泛使用（Micheva 和 Smith，2007）。阵列断层扫描将组织嵌入塑料树脂中，然后进行连续切片、多轮染色和切片阵列成像（图 7E）。

图 7 空间蛋白质组和连接组分析概述。

【总结】

基于水凝胶的组织转化技术的优势在于，研究人员可以轻松修改理化特性，以从完整组织中保存和提取丰富的分子、解剖和功能信息。在这篇综述中，探讨了基于水凝胶的组织转化方法的现状，并概述了它们的基本原理，以帮助研究人员选择、优化和战略性地结合研究技术。此外，该团队讨论了扩大 3D 原位分子表型的困难，并介绍了直接应对挑战的新兴技术。

在过去十年中，组织转化技术领域确实取得了长足的进步。这些进步还与显微技术的并行发展相结合，可以对体积样本进行快速和高分辨率的成像。然而，要最大限度地提高这些技术对研究界的影响，还有很多工作要做。从组织转化、标记和成像到自动图像分析，管道中每一步的持续改进将是必不可少的，因为许多已建立的协议仅限于专业实验室，通常是起源实验室。在此改进过程中，社区将受益于设置可应用于不同技术平台的严格验证标准。考虑到管道内每个组件的密切互连性质，建立有效的工作流程仍然具有挑战性。例如，必须根据所使用的组织转化技术谨慎选择标记和成像技术。社区范围内为各种应用提供详细指南和标准的努力将使跨实验室的技术和协议有效共享。

最令人兴奋的未来方向之一是综合组学方法。最近，空间转录组学被强调为 2020 年年度方法和年度方法：空间解析转录组学，认识到原位细胞和分子空间背景的重要性。此外，水凝胶应用的最新进展不再局限于转录本和蛋白质，还包括功能化的脂质膜。随着技术的不断改进，科学界将能够以单细胞精度从大规模组织中提取空间多组学信息。综合器官尺度的多组学分析将在发现生物系统的基本原理和理解疾病机制方面发挥关键作用。一个主要的挑战将是理解前所未有的基于图像的数据量。因此，开发能够从多尺度 3D 图像中提取定量信息的稳健且高吞吐量的算法将是至关重要的。此外，解释提取的空间多组学信息可能需要新的数学和计算方法。然而，最终，组织转化技术和协同方法的不断进步将释放整体和综合系统级生物学尚未开发的潜力。

参考文献：

doi.org/10.1016/j.cell.2021.07.009

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