异质颗粒水凝胶促进hMSCs的迁移和软骨分化

*仅供医学专业人士阅读参考

点击右上方“关注”，准时接收每日精彩内容推送。

以细胞为基础的诊治关节软骨损伤是昂贵和耗时的；显然，一步法诱导内源性修复将有显著的临床效益。因此，来自苏黎世联邦理工学院的Marcy Zenobi-Wong教授团队探索了非细胞异质颗粒状水凝胶的可注射性、细胞友好的交联和促进迁移的能力，以及作为沉积软骨细胞外基质的支架。采用甲基丙烯酸透明质酸（HAMA）和含硫酸HAMA（SHAMA）的机械施浆制备水凝胶。SHAMA的负电荷允许保留带正电荷的生长因子（GFs）（如TGFB3和PDGF-BB）。HAMA和GFs负载的SHAMA微凝胶的混合物通过酶交联退火，形成具有GFs沉积物的异相颗粒状水凝胶。添加GFs负载的硫酸盐微岛引导细胞迁移和增强软骨生成。与颗粒状或均匀的颗粒状水凝胶相比，颗粒状不均匀水凝胶显示基质沉积和软骨组织成熟增加。这种先进的材料为指导细胞迁移和软骨分化提供了理想的3D环境。

相关研究内容以“Growth factor–loaded sulfated microislands in granular hydrogels promote hMSCs migration and chondrogenic differentiation”为题于2023年4月6日发表在《Acta Biomaterialia》上。

图1 含有页岩微岛的细胞招募的颗粒状水凝胶

如图1所示，本研究的目的是设计一种无细胞颗粒状水凝胶材料，促进软骨下骨和周围软骨的软骨细胞的招募。与自体软骨细胞植入等基于细胞的方法相比，这种手术可以使手术时间更短，总成本更低。

图2 颗粒状水凝胶的表征

压缩模量为11 kPa，膨胀度为100%。用30% DS的HAMA制备的散装水凝胶通过150µm（大）和20µm（小）孔的网格机械挤压3次，得到可注射的（微凝胶，直径为48 ± 20µm（图2A、B）。在20µm和150µm大小的颗粒状水凝胶条件下，颗粒状水凝胶的存储模量分别达到3924 ± 210 Pa和3156±68Pa（图2C）。没有二次退火的微凝胶在PBS中分散，酶交联的微凝胶保持稳定（图2D，左）。通过共聚焦显微镜评估颗粒状水凝胶的形态（图2D，右），显示了适合细胞增殖和ECM沉积的理想的高空隙空间。基于珠粒轨迹的弯曲度和速度的差异，模拟预测了使用20µm大小的微凝胶可以改善孔隙的连通性（图2E）。与150µm微凝胶相比，由20µm微凝胶组成的颗粒状水凝胶的总空隙空间更小（图2F）。接下来，作者评估了生成的颗粒状水凝胶的力学性能和稳定性。压缩试验显示，弹性模量与总空腔空间呈负相关（图2G）。当比较颗粒水凝胶和大体积水凝胶时，降解率没有受到影响（图2H）。综上所述，HAMA微凝胶形成了可塑和稳定的退火结构，可调节孔隙率和互联性作为微凝胶的功能，这允许细胞快速定植。

图3 颗粒状水凝胶中细胞迁移的评价

内源性修复的第一步是细胞迁移，将750个hBMSCs聚集在整体和颗粒状水凝胶中，以评估细胞定植。使用Python脚本分析了100µm z-stack的投影（图3A），并对两个参数进行了量化：芽长（图3B，左）和芽数（图3B，右）。为了进一步研究颗粒状水凝胶和大体积凝胶上的细胞迁移，将少量凝胶前体与hBMSCs混合（荧光标记）加入中间室。在左侧腔室中，加入含PDGF-BB（100 ng/mL）的培养基，在右侧腔室中，加入不含PDGF-BB的培养基，每15 min拍摄一次图像（图3C）。当使用颗粒状水凝胶时，无论是20µm或150µm大小的微凝胶都可以增加平均速度，总距离和线性值（图3D）。

图4 SHAMA水凝胶的物理特性和均质颗粒水凝胶的软骨生成评价

膨胀率显示HAMA水凝胶不膨胀，而SHAMA水凝胶的膨胀最小（图4A）。用FRAP研究了FITC标记的右旋糖酐探针在不同水凝胶配方中的扩散系数（图4B）。通过将20µm大小、25%和50%的微凝胶与hBMSCs孵育48 h并活死染色，评估hBMSCs与不同材料之间的生物相互作用（图4C)。细胞对未加载的SHAMA微凝胶的高附着与SHAMA百分比无关，这表明25%足以对细胞产生影响，而不显著改变水凝胶的物理性质。因此，我们使用25%的SHAMA微凝胶作为GFs微岛，指导BMSCs和软骨细胞的募集。将25%的SHAMA罗丹明标记）微凝胶和HAMA微凝胶（FITC标记）混合，形成异质颗粒状水凝胶（图4D）。将10 M细胞/mL浓度、20µm和150µm水凝胶包裹，在软骨培养基中培养3周，3周后的存活率均高于85%，表明所制备的材料没有产生细胞毒性（图4E、F）。在25% SHAMA微凝胶的存在下，20µm和150µm大小的水凝胶的压缩模量略低于HAMA，但仍在20-40 kPa的范围内（图4G）。以上结果表明，颗粒状水凝胶在实现软骨方面比大块凝胶表现更好；而含有硫酸盐微岛的水凝胶可以促进hBMSCs的软骨生成，并且在局部II型胶原生产方面更有效。

图5 异质性凝胶中的硫酸化微岛促进细胞的迁移和招募

为了验证硫酸化微岛（红色微凝胶）可以在组织样环境中隔离并激发GFs梯度分布，作者将冻干的25% SHAMA和HAMA（作为对照）微凝胶膨胀在含有GFs的TRIS缓冲液中。用ELISA法测定持续2周GFs的释放量（图5A、B)。接着评估了这些非均匀颗粒状水凝胶上的细胞迁移方向，用CellTracker Deep Red标记，并评估两种不同的设置：(1)单细胞迁移，(2)球状体的芽生长（图5C、E）。不同类型的微凝胶组成中，微凝胶与单细胞距离的比值约为1，这一比例随着时间的推移发生了很大的变化，当GFs被封装在硫酸化微凝胶中时，这种现象显著增强（图5D）。微凝胶的大小主要影响芽的数量，而不影响芽的长度，细胞迁移指向SHAMA微凝胶（图5F）。这些结果表明，细胞可以感知异质颗粒状水凝胶中的GF热点，增强细胞的迁移、胶原蛋白的产生和周围区域的增殖，而不需要培养基中的可溶性GFs。

图6 用颗粒水凝胶填充软骨缺损，促进细胞招募和软骨新生形成

为了同时评估软骨生成和细胞迁移，作者设计了一个研究内源性关节软骨修复的相关模型。注射脱细胞异质颗粒状水凝胶，并原位交联到牛骨软骨外植体上的预制软骨缺损中（图6A-C）。进行活/死染色，以评估细胞活力和每个缺损区域的细胞数量（图6D)。当GFs加入时，样品的细胞数量非常高，当硫酸化微岛存在时（含/不含GFs）显著增强（图6E）。每个凝胶质量的DNA含量证实了硫酸化微凝胶可以保留附近细胞合成的GFs，从而继续促进细胞迁移和增殖（图6F）。如图6G所示，在与来自空凝胶的信号进行归一化后，硫酸化微凝胶中GAGs的数量更多。颗粒状水凝胶诱导细胞归巢和ECM的产生，而ECM进而与材料整合到宿主组织中（图6H）。

图7 用牛骨软骨外植体来评估细胞归巢和软骨形成

组织学和免疫组织学分析证实，即使在培养基中没有GFs，HAMA和SHAMA的细胞浸润和组织发育也是可能的（图7A）。Hoechst染色（绿色）定量分析显示在软骨缺损的浅表区有更高的细胞数量，当使用20µm大小的带有硫酸盐微岛的水凝胶时显著增强（图7B）。对于颗粒凝胶的力学性能，当GFs加入材料时，刚度增加到20-50 kPa，明显高于10 kPa左右的初始刚度（图7C）。图6、7的结果证实了HAMA和SHAMA微凝胶的生物相容性，并证明颗粒材料可以促进内源性软骨修复，其特征是高细胞浸润、随时间的机械硬化和软骨样ECM沉积。

综上所述，本研究开发了一种可注射的、原位交联的非均匀颗粒水凝胶，其中包含非共价结合的GFs。尽管软骨的自我修复能力较低，但通过向软骨缺损注射异质颗粒状水凝胶，获得了显著的内源性反应。许多细胞在水凝胶上定植，产生软骨ECM，使凝胶更硬，并增加了颗粒状水凝胶与宿主组织的粘合强度。当使用20µm大小的水凝胶时获得了最好的结果，它具有更高的空隙连通性，并包含GFs加载的硫酸盐微岛。这些结果提示有潜力开发无细胞注射剂来治疗关节软骨缺损，避免使用昂贵的细胞疗法。为了获得更快的转化产品，该凝胶可以装载患者血小板裂解液，而不是商业GFs。由于其简单、高空隙空间和模块化，可以预见加载水凝胶，以招募不同类型的细胞，促进不同组织的修复。

了解更多

关注“EngineeringForLife”，了解更多前沿科研资讯~