膜蛋白纯化-克隆

天然来源的膜蛋白质

膜蛋白质的天然来源可以用作纯化的起始原材料。目前报导的膜蛋白质三维结构数据库中，仅有真核细胞的G蛋白偶联受体－牛视紫红质是从天然的牛视网膜中提取的。因为在牛视网膜中， 视紫红质具有较高的丰度。然而在大多数情况下，目标蛋白质的低丰度使我们不得不放弃对天然材料的使用。

克隆

用于表达可溶性蛋白质的载体均可用于膜蛋白质的制备。为了提高得到有活性的膜蛋白质的机会，一般建议设计10－50个构建体（包括不同的同源蛋白质）。

除了对选择载体的常规考虑之外，还有一些应当需要注意的事项：

• 亲和标签的使用极大地推动了基于色谱技术的膜蛋白质的表达筛选及纯化。组氨酸标签是膜蛋白质表达和纯化时最常用的标签，GST标签和其它标签也已经成功用于膜蛋白质的表达及纯化。通常我们会在标签和靶蛋白质之间插入一个蛋白酶的酶切位点，用以在对膜蛋白质进一步分析前除去标签。
• 6个组氨酸标签是可溶性蛋白质纯化时的标准选择，更长的组氨酸标签（8-10个）通常用于膜蛋白质的表达及纯化，在IMAC色谱纯化过程中，更长的标签能够提高膜蛋白质同色谱基质的结合强度，进而提高其产量。有报导说更长的组氨酸标签（＞6）的使用在某些情况下会导致膜蛋白质的表达水平下降。并且在洗脱时相应的咪唑浓度也应适当提高。
• 由于膜蛋白质是通过N端信号肽进行插膜过程的，因此标签一般会置于膜蛋白质的C末 端，以保证N端的天然功能。
• 如果将荧光蛋白质（如GFP）融合在带有组氨酸标签的膜蛋白质上，会我们更容易监 测靶膜蛋白质在表达，溶解及纯化过程中的行为，从而可以加速对这些过程的优化。