骨骼肌组织工程！一种可扩展受控骨骼肌管构建方法

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地形控制已广泛用于促进骨骼肌形成中的细胞融合过程。偏离凹槽边界的肌管一般具有一致的手性方向，该问题长期以来一直没有得到关注。近日，来自香港城市大学的Ting-Hsuan Chen、Miu Ling Lam教授团队进行了通过协同细胞微形貌和手性向列学形成骨骼肌管的可扩展模式的相关研究。研究成果以“Scalable pattern formation of skeletal myotubes by synergizing microtopographic cues and chiral nematics of cells”为题于2023年03月10日发表在《Biofabrication》上。

本文设计了一种可扩展和受控的方法引导骨骼肌管形成。通过诱导C2C12肌细胞到不同宽度的凹槽图案上，观察到从诱导的第一天起，在宽的凹槽上发育的细胞手性取向增强。涉及细胞迁移和细胞核手性旋转细胞的主动手性运动随后导致肌管的统一手性取向。这些手性肌管形成具有增强长度、直径和宽槽收缩性的特性。Latrunculin A（Lat A）处理抑制细胞的手性旋转和迁移以及肌管的形成，表明细胞手性向心性对肌管形成至关重要。最后，通过安排具有相应补偿角度的宽槽/条纹图案来协同微地形和细胞的手性向心性，形成了复杂和可扩展的肌管图案，为骨骼肌组织工程提供一个新策略。

图1 在沟槽图案RGD-Au-NOA芯片上形成的肌管分析

通过在不同宽度纳米或微槽图案RGD-Au-NOA基质上诱导肌细胞探讨肌管形成。分化8天后，用α-肌动蛋白1染色，在固定区域内检查分析显示窄槽上的肌管密度比平面对照组少15%-25%，100μm槽上多10%。在50um和200um沟槽上检测肌管密度与平面对照相当。此外，所有宽度沟槽图案的平均肌管长度与平面对照相比显著增加。这种提高可能是由于凹槽图案提供了引导细胞排列的地形因素，促进了细胞端对端接触和融合率。此外肌管的手性取向在宽槽图案上也非常明显，肌管的定向角定义为肌管相对于沟槽/芯片边界的长轴。肌管的方向在平坦基底上是随机分布的，但在所有沟槽图案上是单轴排列的。肌管更多的是沿着宽度为0.4和2μm水平方向的凹槽排列。然而，在50、100和200微米宽的沟槽上发现了明显的定向角的负偏差，证明了伴随着肌管的形成，手性定向的改变。

总之，与超细沟槽（0.4和2微米）相比，宽沟槽（100微米）图案可以诱导肌细胞分化成具有更长长度、更大直径和更好收缩性的成熟肌管，表明与超细沟槽上的肌管相比，宽沟槽上的肌管生成明显增强。手性取向也出现在更长更密的肌管的形成过程中，这表明细胞手性在肌形成过程中高度参与。

图2 分化前和分化开始时的细胞定向

为了更好了解沟槽宽度对肌管形成的影响，本文进一步研究了有沟槽RGD-Au-NOA芯片上细胞的定向、旋转和迁移。对于细胞方向的测量，结果显示细胞高度排列在0.4和2微米的沟槽边缘。相比之下，大多数细胞在细胞播种后七小时在宽槽（50、100和200μm）上是随机定向的。之后，随着细胞的汇合，出现了一个负偏手性的排列。表明在肌管形成成熟之前，手性取向早期就已经出现。为了了解手性取向的发展，追踪了细胞在GM中第1天和DM中第2天的迁移。首先监测肌细胞在凹槽图案上的迁移轨迹。在0.4和2μm的沟槽上，细胞迅速感觉到沟槽微地形，并在两天内沿着沟槽边缘迁移。在GM的第1天，细胞在50、100和200微米的沟槽上向各个方向迁移。说明低密度地形因素上细胞之间的额外空间，允许细胞向不同方向迁移，表明手性方向的形成是基于细胞的主动向心性，即在接近汇合时从槽边的细胞传播到远处的细胞。为了探索细胞的手性运动，我们进一步研究了在窄沟（2μm）和宽沟（100μm）上迁移的细胞在迁移过程中的细胞核旋转和迁移转角。结果显示细胞核在2微米的凹槽上无偏见地旋转，而细胞核在100微米的凹槽上两天都表现出ACW偏向的旋转。

以上结果表明，在细胞迁移过程中，细胞核会主动旋转，细胞内的手性可能会引导手性方向的建立和细胞迁移，最终通过细胞的主动向心性导致整个培养物的统一手性方向。相反，在狭窄的沟槽上，细胞核旋转的手性受到抑制，导致0.4和2微米的沟槽上手性取向的消失。由于在分化的后期，在宽沟槽（100微米）上也发现了具有更长的长度、直径和更好的收缩性的成熟肌管，表明细胞的手性可能是增强肌形成的一个不可缺少的重要元素。

图3 肌动蛋白抑制剂对血浆处理过条带调节细胞特异性和肌管分化处理

为了进一步阐明肌动蛋白的本质，利用单细胞旋转分析法筛选了三种肌动蛋白抑制剂。

细胞分散在纤连蛋白（FN）涂层的圆环岛上，周围有细胞排斥性的Pluronic涂层。在旋转分析中，只有具有圆形的单细胞计数。结果显示肌细胞表现出明显的ACW旋转偏差为55.5%，NSC将其增强到62.08%，Simfh 2将其增强到57.01%。然而，对于Lat A的处理，细胞被逆转为56.4% CW偏向。因此，使用Lat A研究细胞手性对肌管形成的影响。接着探讨了基于Lat A处理的成肌作用。肌细胞培养在一个非粘附性培养皿上，其上有宽度为500μm的等离子体处理的微条。结果显示对于未经处理的对照组，在诱导前，肌管及其细胞核的排列方向是随机的，但在肌管形成后出现了一个负方向，在DM中补充Lat A后，肌管和细胞核的方向都出现了相反的正向偏向。在DM中通过Lat A的处理，肌管的形成也减少了约10%。通过同时监测第2天的细胞核旋转和迁移，结果发现，在对照组中，肌细胞保持ACW-旋转偏向，而在Lat A处理下，表现出CW-旋转偏向。同时，迁移（包括侧向运动）也被Lat A所抑制。因此，Lat A处理抑制了细胞的活性手性线粒体，最终导致了肌管形成的减少。

图4 肌管可扩展模式形成

为了将肌管扩展为可扩展斑纹形成，肌管排列成大尺度同心和径向形状。选择100μm宽槽作为基本单位。首先，一个半径为1厘米的圆分成12个相等的区域。在每个扇形区域，肌管设计成与外切线平行以形成同心环图案，与每个扇形区域中线平行以形成辐射状图案。接着100μm的凹槽排列在每个扇形区，与标记的所需的方向有一定的补偿角。分化8天后，通过在水凝胶上排列凹槽实现了肌管的同心环和径向模式。本文还探索了使用等离子体处理的条纹与所需的肌管形成排列一起纳入无细胞部分的可能性。使用100μm宽的等离子体处理过的细胞粘附条带与50μm宽的非处理条带相隔，加以适当的补偿角度。在此基础上，在100微米等离子体处理的条纹（细胞粘附）与50微米非处理的空间（细胞排斥）阵列上，可以形成一个 "CITYU "模式的肌管，证明适当的补偿角度是引导肌管形成可扩展模式的成功工程策略。

总之，本文使用微槽的微地形因素指导肌管的形成，在宽槽（50和100微米）上手性取向增强，同时与那些在窄行槽（0.4-2微米）上的手性取向相比，长度、直径和收缩性都有所增强。对沟槽图案上的细胞定向、迁移和细胞核旋转的研究表明，细胞的主动手性向心性是促进肌管分化的关键。由于肌管的手性排列是不可避免的，也是主动手性的自然结果，本研究开发了一种策略，利用补偿角来协同微地形因素和细胞的手性，引导肌管图案形成。为设计复杂的、可扩展的图案奠定基础，本文结果将对组织重建研究中模式设计产生重大影响。

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