改造"培养皿"发了篇Biofabrication，适用于胰岛高密度培养

各种临床和实验应用（包括细胞疗法）未能满足在高密度培养物中维持细胞球体活力和功能的需求。一个直接的应用是胰岛移植，这是一种临床公认的治疗 1型糖尿病的治疗选择；胰岛从供体中分离出来，用于移植前的后续培养。然而，高接种条件会导致多个球体自发融合，从而限制氧气扩散以诱导缺氧细胞死亡。近日，来自美国希望之城糖尿病代谢研究所的Hirotake Komatsu团队介绍了一种培养皿，该培养皿采用微金字塔图案表面以防止未经请求的融合和透氧底部以获得最佳氧气环境。与临床胰岛移植制剂中使用的常规胰岛培养相比，该培养皿的播种密度提高了2-3倍，表明在4d培养中改善了胰岛形态、代谢和功能。将这些胰岛移植到免疫缺陷糖尿病小鼠体内，与传统培养井中培养的胰岛相比，可以显著改善胰岛的植入以实现正糖。总的来说，这种简单的设计修改允许三维细胞球体的高密度培养，以提高一系列研究和临床替代组织的活力和功能。相关论文“Micropyramid-patterned, oxygen-permeable bottomed dish for high density culture of pancreatic islets”于2022年12月20日发表于杂志《Biofabrication》上。

1. 胰岛融合降低体外生存能力

融合胰岛作为一个更大的单元，对培养物中胰岛的存活有不利影响。研究者以与临床胰岛移植制剂相似的常规胰岛种子密度为100 IEQ cm−2，在平底皿中培养离体大鼠胰岛4d。发现大的、融合的、活/死染色的胰岛经常发生中央坏死(图1A)。整体胰岛和融合胰岛构造的生存能力图显示，生存能力与二维图像中分析的胰岛面积呈负相关(图1B)，融合胰岛结构的面积明显大于单个胰岛(图1C)，融合胰岛结构的生存能力明显低于单个胰岛(图1D)。这些结果表明，预防胰岛聚集可能是维持胰岛质量的重要策略。

图1 胰岛融合降低体外生存能力

2. 用微金字塔图案盘子改进了胰岛样珠的分离

之后，研究者检查了葡聚糖珠粒在三个不同表面上的分布，以确定在这些表面上培养的潜在胰岛分离程度:(a)平面(传统培养皿)，(b)微孔阵列，(c)微金字塔阵列(图2)。结果表明：在高播种密度的微金字塔阵列中，单粒珠的百分比显著最高(在平底、微井和微金字塔中分别为53%、68%和80%)，表明珠分离率最高。

图2 在底部有微金字塔图案的培养皿中防止聚集:仿胰岛珠模型

3. 微金字塔图案培养皿缓解胰岛运动引起的介质氧梯度

然后，研究者评估了平底和微金字塔图案底部在培养前(第0天)和培养后(第3天)胰岛分布的变化(图3A)，结果表明，传统平底中的胰岛比在微金字塔底部培养的胰岛有更多的运动。通过在捕获的图像中计算培养皿中4个区域的胰岛数量来量化胰岛分布的变化(图3B)。分析发现，与预培养相比，在平底中播种的胰岛向中心移动，第1区增加了+165%，第2区增加了-23%，第3区增加了-66%，第4区增加了-81%。另一方面，微金字塔在每个区域都表现出最小的移动(在1-4区分别为5%，-4%，-8%和+10%)。这些结果表明，微金字塔图案的底部减轻了运动诱导的胰岛聚集在培养过程中。

胰岛的移动不仅增加了聚集的风险，而且还引起了培养皿内胰岛分布的不均匀，理论上可以在培养基中产生氧张力(pO2)梯度。研究者模拟了三种不同播种密度条件下胰岛沉积物盘子底层pO2的变化（图3C-D）。结果表明，微金字塔图案的底盘在防止胰岛运动和在培养基中产生氧气梯度方面比平底盘更有优势。然而，在较高播种密度(如IEQ)下，微金字塔型底盘的pO2模拟显示整个盘区pO2的绝对水平下降。这一结果表明，外部氧气供应与微金字塔型培养皿相结合具有改善氧气微环境的潜力。

图3 评估胰岛运动和由此产生的pO2在培养基中的梯度

4. 通过微金字塔图案，可渗透O2的培养皿消除了培养基中的垂直pO2梯度

虽然微金字塔图案的盘子阻止了胰岛的融合和移动，但盘子底层的pO2下降。在碟形中间的横截面平面上对pO2进行了模拟(图4)。模拟结果表明，厚度在150 ~ 800 μm之间的PDMS底盘在300和600 IEQ/dish播种密度下，通过减小垂直O2梯度，有效地改善了盘子底层的O2环境。

图4 底部微金字塔图案，可渗透O2的培养皿消除了培养基中的垂直pO2梯度

5. 微锥体盘高播种量培养中胰岛形态的改善

然后，研究者在高播种密度下培养孤立的胰岛（图5）。微金字塔和微金字塔+O2均能很好地维持胰岛形态，边界分明。相比之下，CTL培养皿中的胰岛边界模糊，表明胰岛退化。形状因子评估胰岛形态，结果表明：与CTL相比，微金字塔和微金字塔+O2显著改善了胰岛形态(图5B)。CTL在4d内显著减少胰岛质量，而微金字塔和微金字塔+O2缓解了胰岛质量的减少(图5C)。

图5 微金字塔图案底盘对高播种量胰岛形态和质量的影响

6. 通过微金字塔模式的O2渗透底盘减轻缺氧诱导的胰岛损伤

培养后的活/死胰岛染色图像显示大量胰岛死亡，CTL中存在大量碎片(图6A)。碎片较少，但小锥体中出现胰岛中央坏死。相比之下，微金字塔+O2使胰岛死亡最小化。图像分析表明，微金字塔模式和O2渗透底部协同提高了胰岛的生存能力（图6B）。HE染色显示胰岛变形，广泛坏死，CTL中细胞质丢失(图6C)。微金字塔培养的胰岛呈圆形形态，但中心坏死，核固缩，而微金字塔+O2可减轻这种细胞损伤。固缩区的图像分析显示了使用微金字塔和可透氧底缓解胰岛损伤的优势(图6D)。微金字塔模式和可渗透O2的底部协同减少了胰岛释放的HMGB1(图6E)。此外，微金字塔+O2维持胰岛素含量明显优于CTL，表明胰岛内的β细胞不受损害(图6F)。

图6 微金字塔模式与透氧底协同防止高播种量胰岛损伤的研究

7. 改善氧环境，增强胰岛代谢和功能

然后，研究者评估了胰岛的代谢（图7）。生物荧光定量分析显示，微金字塔和微金字塔+O2的代谢水平明显高于CTL。CTL培养的胰岛即使在低糖环境中也能分泌高水平的胰岛素，对高糖没有反应，表明胰岛受损。而微金字塔+O2培养的胰岛在低糖环境中胰岛素分泌正常，对高糖溶液反应良好。

图7 高播种密度培养后胰岛的代谢和功能

8. 体外培养胰岛在微锥体图案培养皿上的功能移植

最后，研究者将高播种密度培养的胰岛移植到NOD-scid小鼠肾囊下，进行体内胰岛质量评估（图8）。7周期间的血糖水平变化显示，CTL、微金字塔和微金字塔+O2的糖尿病逆转率分别为50%(2/4)、75%(3/4)和100%(4/4)。与CTL相比，0-6周血糖水平的AUC在微金字塔和微金字塔+O2中均显示出更好的血糖控制。移植后4周的糖耐量试验表明，微金字塔和微金字塔+O2培养皿培养的胰岛移植后功能优于CTL培养的胰岛。这也表明，与CTL相比，微金字塔和微金字塔+O2有效植入后培养的胰岛质量有所改善。

图8 高播种密度培养胰岛在体内移植中的功能评估

综上，本文采用结构简单的微金字塔阵列和可透氧底修饰相结合的策略，实现了离体胰岛的高播种密度培养。与在常规培养孔中培养的胰岛相比，将这些胰岛移植到免疫缺陷糖尿病小鼠中表现出显着改善的植入以实现正常血糖。总的来说，这种简单的设计修改允许高密度培养三维细胞球状体，以提高一系列研究和临床替代组织的活力和功能。

文章来源：

https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/aca79a