研究表明SARS2在人脑组织中的感染、复制和持久性

研究表明SARS-CoV-2在人脑组织中感染、复制和持久性

在最近发表在《Nature》杂志上的一项研究中，研究人员调查了人类SARS-CoV-2的细胞趋向性、复制能力、持久性和进化，以及受感染组织的相关组织病理学变化。

据报道，新冠肺炎在急性期引起多器官功能紊乱，少数感染者出现持续症状，称为PASC（COVID-19急性后遗症）。然而，非呼吸系统疾病负担和SARS-CoV-2从非呼吸系统组织（如大脑）清除的持续时间尚未得到广泛研究。

关于研究

在本研究中，研究人员绘制并量化了SARS-CoV-2在非呼吸人体组织（如大脑）中从急性新冠肺炎期到症状出现后>7.0个月的分布、增殖和细胞趋向性。

在2020年4月26日至2021年3月2日期间，分析了44名未接种疫苗和已故新冠肺炎患者的尸检脑标本，并对11名个体进行了广泛的CNS（中枢神经系统）采样。进行了聚合酶链反应 (PCR) 分析确认SARS-CoV-2阳性，发现38个样本为SARS-CoV-2阳性。三个样本（P27、P36和P37）的SARS-CoV-2血清反应呈阴性，三个样本（P3、P4和P15）无法获得血清。

图1：SARS-CoV-2在人体和大脑中的分布、量化和复制

热图描绘了11名死于新冠肺炎并接受全身和大脑采样的患者尸检组织中存在的通过ddPCR对SARS-CoV-2 RNA (N) 进行的最高平均量化。患者在死亡前从最短到最长的病程（DOI）排列，列在图的底部，并分为早期（≤14天）、中期（15-30天）和晚期（≥31天）持续时间疾病。组织按组织组组织，从顶部的呼吸组织和底部的CNS开始。病毒RNA水平范围为每纳克RNA输入0.002至500,000个N基因拷贝，描绘为从最低水平的深蓝色到最高水平的深红色的梯度。亚基因组RNA (sgRNA+) 通过实时RT–qPCR用黑色垂直条阴影。O，其他；PNS，周围神经系统；SM，骨骼肌。

对SARS-CoV-2 N（核衣壳）基因进行了液滴数字PCR (ddPCR) 分析，并进行了ISH（原位杂交）分析以验证ddPCR结果并确定SARS-CoV-2细胞向性。进一步进行 IF（免疫荧光）和 IHC（免疫组织化学）分析以验证病毒在人脑组织中的存在。

此外，使用实时定量逆转录PCR (RT-qPCR) 分析检测亚基因组核糖核酸 (RNA)，并使用Vero E6细胞进行病毒分离实验以证明SARS-CoV-2在呼吸道组织中具有增殖能力和另一个起源。使用HT-SGS（高通量、单基因组扩增和测序）分析对六个个体进行了SARS-CoV-2 S（刺突）基因变异多样性和分布测量。

尸检标本中，根据感染时间14天以内、15天至30天、31天以上死亡，分为早期、中期和晚期病例17例、13例和14例， 分别。此外，对16个人的室间隔组织进行了图像分析，以评估ddPCR分析检测到的SARS-CoV-2 N RNA与ISH分析检测到的SARS-CoV-2 S RNA之间的关联。此外，还进行了N蛋白靶向ISH测定、IF分析和基于IHC的分析，以验证SARS-CoV-2在CNS中的检测和分布。

研究结果

在研究对象中，30%是女性，年龄中位数为63岁，其中61%患有至少三种合并症。从出现症状到入院和死亡的中位持续时间分别为6天和19天，中位尸检持续时间为22小时。

SARS-CoV-2核糖核酸存在于84个解剖部位，在呼吸组织中的含量明显高于其他组织。早期病例、中期病例和晚期病例中的 SARS-CoV-2 RNA水平为每纳克RNA有2.0 log10核衣壳基因拷贝，每纳克RNA有1.4 log10核衣壳基因拷贝，每纳克RNA有0.7 log10核衣壳基因拷贝，分别。在11例早期病例和1例早期病例和中期病例的临终血清中检测到SARS-CoV-2核糖核酸。

SARS-CoV-2核糖核酸持续存在于晚期病例的几个组织中，尽管在任何病例的血清中都低于可检测水平。SARS-CoV-2核糖核酸在91% (n=10) 个病例的中枢神经系统中被鉴定出来，包括在五个（六个中的）晚期病例中评估的大多数大脑区域。在所有组织和几种体液（包括血清、玻璃体液和胸膜液）中检测到SARS-CoV-2亚基因组核糖核酸。

亚基因组核糖核酸RT-qPCR分析和ddPCR分析结果与1,025个样本密切相关，特别是369个呼吸道样本、496个早期病例和302个通过RT-qPCR和ddPCR分析显示SARS-CoV-2阳性的样本。SARS-CoV-2在早期病例淋巴结、心脏、肾上腺、胃肠道组织和眼组织的45% (n=25) 标本的Vero E6细胞中分离出来。

图2：肺外组织中SARS-CoV-2的RNA原位检测（RNAscope）

a–h，SARS-CoV-2病毒定位于高尔基体和内质网，外观呈核周状，存在于以下器官和细胞类型中（放大倍数×500，比例尺，2μm，所有图）：P19的甲状腺，显示滤泡细胞 (a) 中存在病毒，P18的食道，证明复层鳞状上皮细胞（星号）中存在病毒，以及基质内毛细血管中的信号（散列）(b)，P19的脾脏，证明白髓中单核白细胞中存在病毒 (c)，P19附录，表明病毒存在于结肠上皮细胞（星号）和间质单核白细胞（散列）中（d), P19的肾上腺, 证明内分泌细胞 (e) 中存在病毒, P18的卵巢, 证明绝经后卵巢 (f) 的卵巢基质细胞中存在病毒, P20的睾丸, 证明支持细胞（星号）和睾丸生精小管（散列）（g）、P35子宫内膜中成熟生殖细胞中均存在病毒，表明病毒存在于子宫内膜腺体上皮（星号）和基质细胞（散列中), 在绝经前子宫内膜样本 (h) 中。这些图像是在20批次ISH染色过程中SARS-CoV-2 N RNA呈阳性的肺外组织样本。

此外，从Vero E6-跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)-T2A-血管紧张素转换酶2 (ACE2) 细胞的P38丘脑中分离出SARS-CoV-2。对来自6个个体的46个标本进行HT-SGS分析未显示呼吸组织和其他组织中P18、P19和P27存在任何非同义SARS-CoV-2基因组多样性。在P27样本中，优先在纵隔淋巴结和左右心室等非呼吸组织中检测到两种SARS-CoV-2单倍型，每一种都包含一个同义突变。

图3：SARS-CoV-2蛋白和RNA在人CNS组织中的表达

a，来自P38的下丘脑的高倍放大可视化，标记为 SARS-CoV-2 N蛋白（绿色）和神经元核 (NeuN) 蛋白（洋红色），通过IF显示神经元（白色箭头）中的病毒特异性蛋白表达。右侧和底部的z堆栈正交视图显示细胞核中的 NeuN 标记和细胞质中的SARS-CoV-2蛋白（红色箭头）。b–d，ISH的SARS-CoV-2刺突 (S) (b) 和N (c) RNA（棕色）和P38下丘脑显色IHC的SARS-CoV-2 N (d) 蛋白（棕色）。电子, IF在P42的颈脊髓中发现了感染的神经元，其中白色箭头表示具有相关病毒蛋白的NeuN阳性神经元。病毒蛋白标记也在从神经元细胞体辐射出去的线性结构中被识别出来，这表明神经元投射（黄色箭头）。f , 神经元相关病毒蛋白标记的更高放大倍数。g，IF还在P42（白色箭头）的颈脊髓水平的脊神经节神经元中检测到病毒蛋白。h–j，ISH检测的 SARS-CoV-2 S (h) 和 N (i) RNA以及P42颈脊髓显色IHC检测的SARS-CoV-2 N (j) 蛋白。k–m、ISH的 SARS-CoV-2 S (k)和N (l) RNA以及显色IHC的SARS-CoV-2 N (m)蛋白，所有这些主要存在于颗粒层(GL) 中，如下所示与P38小脑的分子水平 (ML) 相比。WM，白质。n , o , SARS-CoV-2 S (n) 和 N (o) RNA，ISH和SARS-CoV-2 N (p) 通过P40基底神经节的显色IHC检测病毒蛋白。Hoechst 33342用于识别所有IF图像中的细胞核（蓝色），并且IF图像是通过共聚焦显微镜获得的。苏木精用作复染剂，所有ISH和显色IHC图像均通过明场显微镜获得。比例尺，15μm (a)、10μm (b–d , g–p) 和25μm (e , f)。

在P38中，在所有31个呼吸系统中检测到残留D80F，但没有490个颅骨序列和残留G1219V仅限于颅骨变体。在室间隔组织中，平均SARS-CoV-2 N基因拷贝/纳克 RNA与中位SARS-CoV-2 S RNA阳性细胞显着相关。在第二次ISH检测中，在P38的小脑和下丘脑、P40的基底神经节和P42的颈脊髓中观察到SARS-CoV-2 RNA和蛋白质。

组织病理学分析结果表明，92%（n=35）的病例死于弥漫性肺泡损伤或急性肺炎，弥漫性肺泡损伤病例呈时间性进展模式。观察到心肌浸润，皮质旁和滤泡增生。然而，尽管SARS-CoV-2 RNA在体内广泛分布，但在非呼吸道组织中观察到直接SARS-CoV-2细胞病理学或炎症的证据微不足道。

总体而言，研究结果表明，SARS-CoV-2可以在感染早期感染大脑等非呼吸组织并在其中复制，并在症状出现后持续数月（最多230天）。

Journal reference:

• Stein, S.R., Ramelli, S.C., Grazioli, A. et al. (2022). SARS-CoV-2 infection and persistence in the human body and brain at autopsy. Nature.
• doi:https://doi.org/10.1038/s41586-022-05542-y