清华张翀/江大刘秀霞 - 揭示谷氨酸棒杆菌高效分泌蛋白的关联基因

20 世纪 70 年代，斯坦福大学的 Stanley Cohen 与加州大学的 Herbert Boyer 通过重组质粒的方式，首次将异源基因成功转移到大肠杆菌中表达，这次 DNA 重组实验标志着基因工程技术的诞生，也开启了重组蛋白光辉璀璨的历史发展。1976 年，Boyer 等人创立了第一家基因工程公司基因泰克；1982 年，基因泰克研发出世界上第一个利用基因重组技术表达的蛋白——重组人胰岛素。时至今日，重组蛋白已经在我们的生活中扮演着不可或缺的角色，其产品种类众多，被广泛应用于医疗、食品、化工、科研试剂等诸多领域。

目前，重组蛋白微生物细胞工厂主要采用表达元件优化和底盘菌株改造相结合的构建流程。然而，由于生物系统的多层次结构及复杂性，特别是缺乏系统理解基因组未知位点对重组蛋白合成及分泌的影响机制，现有的底盘菌株改造仍主要依赖于“试错”方法，开发周期长、成本高、产品生产效率低。因此，如何在全基因组范围内快速、高效地挖掘蛋白分泌关联基因位点是提高微生物蛋白细胞工厂设计效率的重要研究方向。

近日，清华大学化工系生物育种技术与装备团队和江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心白仲虎团队合作，在代谢工程领域国际知名期刊 Metabolic Engineering 上发表了题为“CRISPRi-microfluidics screening enables genome-scale target identification for high-titer protein production and secretion”的文章，论文通讯作者为清华大学张翀和江南大学刘秀霞。文章提出了“CRISPRi-微流控筛选”策略（图 1），通过建立全基因组规模 CRISPRi 文库，结合高通量的分泌蛋白表征技术和液滴微流控筛选平台，在新兴的重组药物蛋白表达宿主——谷氨酸棒杆菌中绘制了蛋白分泌的基因型-表型关联图谱，系统地揭示了其基因组中能够用于改善分泌蛋白生产的基因位点，并最终指导构建了高效分泌重组蛋白的底盘菌株。

▲图 1 | CRISPRi-微流控筛选的概述图

谷氨酸棒杆菌是一种用于生产具有经济价值的蛋白的新兴宿主生物。近年来，谷氨酸棒杆菌被广泛应用于重组药物蛋白的生产，由味之素公司开发的谷氨酸棒杆菌表达系统 CORYNEX® 已成功商业化进入市场。在这项研究中，研究团队首先设计构建了谷氨酸棒杆菌中的第一个全基因组规模 CRISPRi 文库，以 46,549 条 sgRNA 实现对基因组 99.71% 蛋白质编码基因和 85.36% 非编码基因的遗传扰动；以纳米抗体 VHH 作为模式分泌蛋白，使用建立的液滴微流控平台对文库中超过 50 万个单细胞进行了筛选。

通过三轮分选文库的基因型分析，研究团队绘制了谷氨酸棒杆菌蛋白分泌的基因型-表型关联图谱（图 2），揭示了包括氧化还原调控、氨基酸代谢、ABC 转运体等生物过程中存在大量提高分泌蛋白产量的潜在靶点。

▲图 2 | 谷氨酸棒杆菌蛋白分泌的基因型-表型关联图谱

此外，研究人员通过重构实验与表型性能评价明确了 24 个可以提高 VHH 产量的有效基因靶点，其中，抑制 8 个氨基酸代谢途径中的基因靶点使VHH产量提高了 8.8%~48.1%，抑制 8 个 ABC 转运体相关基因使 VHH 产量提高了 4.3~48.1%；揭示了氧化还原相关转录因子是影响谷氨酸棒杆菌分泌蛋白产量的重要基因位点，并通过氧还转录因子 CosR 和 RshA 的组合敲除构建了 VHH 产量提高 2.78 倍的底盘菌株，并用于 I 型骨胶原前肽和单链可变区片段 scFv 的高效分泌生产（图 3）。

▲图 3 | 氧还转录因子工程构建高效蛋白分泌菌株

值得注意的是，这项研究中利用的高通量筛选平台是以双砷-四半胱氨酸反应为基础设计的，其处理通量可达到>105 个单细胞/天。通过反应体系和操作流程的优化，成功在皮升级液滴水平建立了非酶依赖的分泌蛋白产量表征方法。

▲图 4 | 基于双砷-四半胱氨酸反应的液滴微流控筛选平台，红色虚线内为三次微流控操作及相应的实拍图

由于 CRISPR 技术和基于双砷-四半胱氨酸反应的液滴微流控筛选平台的普适性，该研究中的“CRISPRi-微流控筛选”平台未来或被广泛应用于各种原核宿主和不同蛋白的分析，助力下一代微生物蛋白细胞工厂的创制。