原代T细胞难转染？那是工具没选对~

T细胞(T cell、T淋巴细胞/T lymphocyte)是淋巴细胞的一种，在免疫反应中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中。随着细胞免疫治疗的日益深入，T细胞的基因工程化改造显得越来越重要。

然而，T细胞的基因操作却异常困难，普通的DNA质粒根本就转不进去，即使是病毒介导的基因转染操作，也有不少难题，主要体现在几个方面:

1 常规的慢病毒，由于

• T细胞膜上受体的不稳定；

• 非激活的T细胞本身无增殖能力；

• T细胞内部有阻碍反转录的机制等原因而导致慢病毒的T细胞感染能力 偏弱，需要多次重复感染，且对于实验操作的条件要求十分苛刻

2体外培养的T细胞本身十分敏感且脆弱，慢病毒感染对细胞的状态影响非常大

3T细胞是悬浮细胞，进一步增大了病毒感染的难度

遇上这样“磨人的细胞”怎么办？

汉恒病毒载体工程师们深切体会到了大家的痛苦

通过多次实验，研发出适用于原代T细胞基因操作的悬浮细胞专用的腺病毒（Ads）和慢病毒（hTLv）。其中Ads也非常适用感染其他悬浮细胞，如Jurkat，K562，HL-60和L1210等。慢病毒hTLv适用人原代T细胞的感染还可以用来构建稳转系。

感染效果图

汉恒原代T细胞感染实例——使用悬浮细胞专用腺病毒ads感染

悬浮细胞专用腺病毒Ads感染小鼠原代CD4+ T细胞

细胞：小鼠原代CD4+ T细胞

刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h

病毒：Ads-GFP, 1×10^10 PFU/ml

使用方式：MOI=500

悬浮细胞专用腺病毒Ads感染人原代CD4+ T细胞

细胞：人原代CD4+ T细胞

刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h

病毒：Ads-GFP， 1×10^10 PFU/ml

使用方式：MOI=100

汉恒原代T细胞感染实例——使用慢病毒

原代T细胞专用病毒-慢病毒感染人原代CD4+ T细胞

细胞：人原代CD4+ T细胞

刺激方式：CD3/CD28抗体和IL-2激活48h

病毒：hTLv-GFP，1*10^8 TU/ml

使用方式：MOI=50

上文我们了解到T细胞是很难被感染的，除了使用正确的病毒工具外，在细胞制备后想要成功感染T细胞还有两个关键步骤：细胞体外刺激、细胞感染

细胞体外刺激

1. 按照小鼠或人源 CD4+T 细胞分离 kit (Thermo) 说明书分离得到 CD4+T 细胞。

2. 取所需体积的 PBS，按照 5 μg/ml 的终浓度加入 Anti-mouse CD3e 和 Anti-mouse CD28 抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置 4 h，吸掉抗体悬液，加入 500 μl 1% BSA（PBS 配置）室温封闭 30 min，封闭结束加入 500 μl PBS 洗孔一次。

注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。

3．将分离得到的 CD4+ T 按照浓度 5x105 cell/ml 重悬在完全 T 细胞培养基中（1640，10% FBS，1% penicillin-streptomycin， 50 μM β-mercaptoethanol, 100 U/ml IL-2），将细胞加入步骤 2 中包被处理好的平板，2 ml 每孔（1x106 cell/well），然后放入 37℃ CO2培养箱刺激培养 48 h。细胞在刺激 24 h 后体积略微增大，进入活化状态，刺激 48 h 后可进行病毒感染。

细胞感染

1. 收集活化好的 CD4+T 细胞，400 g 离心 5 min。用 T 细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。

2. 另取一 Anti-mouse CD3e 和 Anti-mouse CD28 抗体包被好的 24 孔板，每孔加入 2-5x105 的细胞（若为 96 孔板，加入 2x104 细胞/孔）。若考虑长期表达目的基因，按 MOI=50-100 加入汉恒生物 T 细胞专用慢病毒 hTLv-GFP，注意鼠源和人源原代 T 细胞所适合的慢病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按 MOI=500-1000 加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒 Ads-GFP。同时加入 polybrene 至终浓度 6 g/ml，最终感染体积为 500 μl，加入病毒后轻轻吹打混匀。

注：具体 MOI 选择可在 96 孔板中预实验进行梯度摸索，对于慢病毒建议使用 10，30，100 的梯度进行，对于腺病毒建议使用 500，1000，1500 的梯度进行摸索。

3. 24-wellplate 于 1000 g 室温离心感染 90 min。离心结束后将平板放入 37℃ CO2 培养箱感染 6 h。

注：离心结束观察细胞分散状态，除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。

4. 感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中 350 μl 的培养基（70%），加入 1.85 ml 的 T 细胞完全培养基补足体积为 2 ml 并吹打混匀。

5. 可选步骤：病毒感染 24 h 后，小心吸掉培养基，在同一培养皿中按照 2-4 步进行病毒复感染操作。

6. 将细胞放入 37℃ CO2 培养箱继续培养，2～3 天后可观察荧光，做流式检测感染效率。正常情况下，汉恒生物提供的 T 细胞专用慢病毒（hTLv）和悬浮细胞专用腺病毒（Ads）感染原代 T 细胞的效率大于 50%。